ВИТАМИНЫ ГРУППЫ А

Общие сведения.

К группе витаминов А относятся несколько веществ, близких по строению и физиологическим функциям.

Витамин (ретинол) образуется при расщеплении желто-оранжевых пигментов растений — каротиноидов — в печени и слизистой оболочке тонких кишок при участии фермента каротиназы

Таким образом, каротиноиды являются провитаминами А. В витамин превращаются а-, и у-каротины, криптоксантин и некоторые другие каротиноиды. Наиболее активен -каротин, в состав молекулы которого входят два кольца р-ионона:

При расщеплении симметричной молекулы -каротина освобождаются две молекулы витамина

Молекула а-каротина состоит из одного -иононового кольца и одного кольца а-ионона. В состав молекулы у-каротина входят кольца -ионона и псевдоионона. Вот почему при расщеплении а- и у-каротина образуется лишь одна молекула витамина

Витамин содержится в печени и почках животных, печеночных жирах морских рыб (морского окуня, тунца, лосося, трески, камбалы и др.), мясе рыб (сельди, карпа и т. д.), молоке и молочных продуктах, яйцах.

Витамин — циклический высокомолекулярный спирт. В его молекуле содержится кольцо р-ионона и боковая цепь, в состав которой входят два остатка изопрена и метоксильная группировка. По новейшим данным, наряду с алкоголем ретинолом обнаружены витамин — альдегид, называемый ретиналем, и витамин — ретиноваа кислота.

Витамин (дегидроретинол) найден в печени пресноводных рыб. Он отличается от витамина наличием добавочной двойной связи в кольце -ионона:

Провитамин неизвестен. Как и у витамина известны три формы витамина спирт — дегидроретинол, альдегид — дегидроретиналь и дегидроретиновая кислота.

В печени млекопитающих найдено вещество, названное витамином Соединения, характеризующиеся свойствами витамина А, выделены также из печени кита (ки-тол), жира акулы и т. д.

Суточные нормы потребности человека в витамине А составляют: 1) для взрослых - 1,5 мг; 2) для беременных и кормящих женщин — 2 мг; 3) для детей: до 1 года — 0,5 мг, от 1 до 3 лет — 1мг, от 4 до 6 лет — 1 мг, от 7 до 15 лет - 1,5 мг; 4) для юношей и девушек (от 16 до 22 лет) — 1,5 мг.

При потреблении каротина норма повышается в два раза.

Качественные реакции на витамины группы А. Реакция с треххлористой сурьмой (Карр-Прайса). При взаимодействии витамина А с треххлористой сурьмой образуются соединения, обладающие синей окраской. Предполагают, что при протекании этой реакции имеет место водоотнимающее действие треххлористой сурьмы и образование окрашенных продуктов конденсации.

Реактивы: а) треххлористая сурьма -ный раствор в хлороформе. Хлороформ промывают 2—3 раза равными объемами дистиллированной воды, воду сливают и хлороформ для высушивания взбалтывают с прокаленным сернокислым натрием или углекислым калием, затем отделяют от соли и перегоняют (в затененном месте, избегая прямого действия света). Первые 10—15 мл дистиллята отбрасывают. Перегнанный хлороформ хранят в склянке оранжевого стекла с притертой пробкой, на дно которой насыпают немного прокаленного сернокислого натрия или углекислого калия (для поглощения следов воды). Кристаллы треххлористой сурьмы промывают перегнанным хлороформом до тех пор, пока растворитель не перестанет окрашиваться, после чего готовят насыщенный при комнатной температуре (20° С) раствор. Хлороформный раствор треххлористой сурьмы хранят в склянке оранжевого стекла с притертой пробкой. Он пригоден к употреблению через 6-8 ч после приготовления. Срок годности — две недели; б) рыбий жир, медицинский. Берут только свежий препарат, так как старый или прокипяченный рыбий жир практически лишены витамина А; в) масляный раствор ретинола-ацетата (витамина ); г) хлороформ.

Несколько капель рыбьего жира или одну каплю масляного раствора ретинола-ацетата растворяют в 1 мл хлороформа (в тщательно высушенной пробирке). К 1 капле раствора прибавляют 5 капель хлороформного раствора треххлористой сурьмы. Появляется неустойчивое голубое или синее окрашивание (в зависимости от концентрации ретинола в растворе).

Реакция с серной кислотой. Под воздействием концентрированной серной кислоты растворы витамина А приобретают сине-фиолетовую окраску, возникновение которой связано с водоотнимающим действием реактива. Окраска является нестойкой и быстро сменяется буроватой, вследствие образования липохрома.

Реактивы: а) рыбий жир, медицинский. Употребляют только свежий препарат (см. предыдущую работу);

б) серная кислота, концентрированная ;

в) хлороформ.

1 каплю рыбьего жира растворяют в 20—25 каплях хлороформа, к раствору добавляют 1 каплю концентрированной серной кислоты и встряхивают. Появляется сине-фиолетовое окрашивание, которое вскоре переходит в красновато-бурое и бурое.

Определение содержания каротинов в растительных объектах

(по прописи Всесоюзного научно-исследовательского института растениеводства). Каротины экстрагируют ацетоном или этиловым спиртом и выделяют из смеси пигментов на хроматографической бумаге. Каротины элюируют из хроматограммы петролейным эфиром или низкокипящим бензином и их содержание определяют путем колориметрирования.

Реактивы и материалы: а) петролейный эфир (температура кипения 60—70° С) или бензин (температура кипения 70—80° С); б) ацетон или этиловый спирт, 95-96%-ный; в) хроматографическая бумага марки «быстрая» Ленинградской бумажной фабрики им. Володарского (вес углекислый натрий или углекислый кальций, д) азобензол, перекристаллизованный из спирта и высушенный. 145 мг препарата растворяют в 100 мл 96%,-ного этилового спирта (в мерной колбе). Из указанного основного раствора готовят рабочий, разбавляя его спиртом в 10 раз (также в мерной колбе на 100 мл). 1 мл рабочего раствора азобензола соответствует 0,00235 мг каротина. Растворы (основной

и рабочий) хранят в темном месте; е) стеклянный или кварцевый песок.

Приборы и посуда: а) концентрационный колориметр или колориметр-нефелометр; б) стеклянные сосуды цилиндрической формы, высота 25—30 см, диаметр 13—15 см, с притертыми пробками или крышками, или батарейные стаканы с притертыми стеклянными пластинками; в) ступки фарфоровые-, г) мерные цилиндры на 100 мл с притертыми пробками.

Навеску растительного материала (1—10 г в зависимости от предполагаемого содержания каротинов) растирают в ступке с ацетоном или спиртом, добавив немного стеклянного или кварцевого песка и щепотку углекислого натрия или химически чистого мела (углекислого кальция) для нейтрализации кислот. Ацетон или спирт приливают небольшими порциями (по 10—15 мл). Экстрагирование повторяют несколько раз. Вытяжки сливают в мерный цилиндр на 100 мл. Извлечение продолжают до получения бесцветного экстракта. Раствор в мерном цилиндре доводят ацетоном или спиртом до определенного объема (50—60—75—100 мл).

Хроматографическую бумагу нарезают на полоски длиной 25 см и шириной 15 см.

0,5-1 мл ацетонового (или спиртового) раствора пигментов наносят (в виде полосы) на полоску хроматографической бумаги на расстоянии 4 см от ее нижнего края. Бумагу подсушивают на воздухе (лучше всего с помощью фена) в затененном месте и затем сворачивают в однослойную трубку, верхний конец которой сшивают или скрепляют пластмассовой скрепкой. Трубку ставят на дно стеклянного сосуда, куда заранее был налит петролейный эфир или низкокипящий бензин слоем в 2—3 см (он должен быть ниже места нанесения раствора пигментов на бумагу). Через 20—30 мин. бумажную трубку вынимают из сосуда. Вырезают полоску бумаги, окрашенную в желто-оранжевый цвет (она находится сразу же за фронтом подъема растворителя), измельчают ее (нарезают) в стеклянный бюкс или стаканчик и извлекают каротины небольшими порциями (по 1-2 мл) петролейного эфира или бензина, повторяя экстрагирование до получения бесцветного раствора. Раствор каротинов доводят этими же растворителями до определенного объема (например, 10-20 мл) и колориметрируют, употребляя в качестве

стандартного рабочий раствор азобензола (14,5 мг в 100 мл). Содержание каротина (в миллиграммах на 100 г продукта) рассчитывают по формуле

где — объем ацетонового (или спиртового) экстракта пигментов в мерном цилиндре, — объем ацетонового (или спиртового) экстракта, нанесенный на бумагу, из — объем раствора каротинов в петролейном эфире или бензине, взятый для колориметрирования, — показания шкалы колориметра для стандартного раствора; — показания шкалы колориметра для исследуемого раствора (среднее из 5—6 определений); — навеска растительного материала, г.

При колориметрировании каротинов пользуются синим светофильтром.

Спектрофотометрический метод определения содержания витамина A1 (ретинола) в рыбьем жире

(по Государственной Фармакопее СССР, изд. 10-е, 1968). Реактивы и материалы: а) рыбий жир тресковый (медицинский), б) едкое кали, водный раствор; в) этиловый спирт, -ный, не содержащий альдегидов. Для проверки на альдегиды к 10 мл спирта добавляют 10 мл воды, -ного раствора азотнокислого серебра и (по каплям) раствор аммиака до исчезновения образующегося вначале осадка. Смесь ставят в темное место на 12 часов. Она должна оставаться бесцветной и прозрачной: г) этиловый спирт абсолютный, -ный (по объему). Для получения его к 95%-ному спирту-ректификату прибавляют негашеную известь в таком количестве, чтобы куски ее выступали над поверхностью жидкости в колбе. Соединяют колбу с обратным холодильником, снабженным хлоркальциевой трубкой с негашеной известью, осторожно нагревают на водяной бане (при температуре не выше 75° С) в течение часа и затем оставляют стоять на два дня. Через два дня отгоняют спирт в колбу Бунзена, которую плотно соединяют с холодильником. Отводную трубку колбы соединяют с хлоркальциевой трубкой. Концентрация такого спирта составляет около 99,5%. Для более полного удаления влаги к 99,5%-ному спирту добавляют твердый едкий натр или едкое кали (10 г на 1 л) и перегоняют, отбрасывая начальная

и конечную фракции; д) диэтиловый эфир; е) сернокислый натрий, прокаленный. Сохраняют в сосуде с притертой пробкой.

Приборы, аппаратура и посуда: а) спектрофотометр или СФ-16; б) делительные воронки; в) колбы конические емкостью 100 мл; г) колбы для отгонки; д) баня водяная; е) баллон с азотом.

В конической колбе емкостью 100 мл отвешивают на аналитических весах около 1 г жира, прибавляют 30 мл этилового спирта, не содержащего альдегидов, и -ного раствора едкого кали. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и ставят на 30 мин. в горячую водяную баню (85—90° С). После омыления колбу охлаждают, добавляют 50 мл воды и содержимое переносят в делительную воронку. Неомыляемую фракцию три раза экстрагируют диэтиловым эфиром, при этом первый раз берут 50 мл его, а во второй и третий — по 30 мл. Все эфирные вытяжки сливают в другую делительную воронку и несколько раз промывают водой до полного удаления остатков щелочи (проба с фенолфталеином). Для обезвоживания к промытой эфирной вытяжке добавляют 8 г прокаленного сернокислого натра и ставят на 30 мин. в темное место, время от времени встряхивая, после чего фильтруют через сухой бумажный фильтр в колбу для перегонки. Сернокислый натрий на фильтре несколько раз промывают диэтиловым эфиром (берут каждый раз по , который фильтруют в ту же колбу. Эфир отгоняют на водяной бане при температуре до 40° С (если отгонку ведут в токе азота, температуру бани можно повысить до 47—50° С).

Примечание. Отгонку эфира рекомендуется вести в токе азота, учитывая легкую окисляемостъ ретинола; в студенческой боте, рассчитанной на ознакомление с методом, отгонку допускается проводить на воздухе (под тягой!), соблюдая противопожарные мероприятия.

После отгонки эфира неомыляемый остаток растворяют в абсолютном этиловом спирте до получения раствора, содержащего в международных единиц (ME) витамина А (при изготовлении раствора учитывают, что в 1 г невитаминизированного рыбьего жира должно содержаться не менее 350 ME витамина А; в 1 г витаминизированного рыбьего жира содержится

ретинола). Изменяют оптическую плотность раствора спектрофотометре в кювете с толщиной слоя 1 см при длинах волн 311, 324,5 и 334 нм.

Содержание витамина А в международных единицах в 1 г жира вычисляют по формуле

где -оптическая плотность раствора при длине волны 324,5 нм; — то же при длинах волн 311 и 334 нм; V — разведение, — навеска жира, г; 1850 — коэффициент перевода в международные единицы.

Примечание. Одна международная единица витамина А равна 0,3 мкг.