Разделение белка и низкомолекулярных примесей методом гельфильтрации на сефадексе G 25 (по Р. Мардашеву, А. А. Покровскому, Н. А. Павловой, с дополнениями)

Общие сведения.

Метод гельфильтрации (гельхрома-тографии) щироко используется в биохимии и биохимической технологии для фракционирования и очистки высокомолекулярных веществ, концентрирования их в растворах, обессоливания биологических субстратов, определения молекулярного веса и т. д. Он основан на способности низкомолекулярных веществ проникать внутрь частиц наполнителя. В то же время большие частицы высокомолекулярных соединений проходят мимо частиц геля, вследствие чего скорость прохождения веществ через колонку с наполнителем будет различной: высокомолекулярные соединения фильтруются быстрее, а низкомолекулярные задерживаются на колонке.

При гельфильтрации широко применяются сефадексы. Сефадексы — высокополимерные поперечносшитые полисахариды (декстраны), обладающие сильно гидрофильными свойствами. Они устойчивы к действию органических растворителей, растворов щелочей и разбавленных кислот, разрушаются сильными кислотами (например, 0,1 н раствором соляной кислоты) и сильными окислителями.

Сефадексы различаются размерами частиц, а также количеством поперечных связей («сшивок»), что в свою очередь определяет степень набухания высокополимера. Различные марки сефадекса отличаются способностью к набуханию, на которую указывает номер геля. Номер определяет десятикратное количество воды, которое может удержать 1 г сухого сефадекса. Так, например, 1 г сефадекса G-15 способен поглотить 1,5 мл воды, сефадекса G-25-2,5 мл.

Для расчета количества сефадекса, необходимого для заполнения колонки, надо знать его удельный объем, который будет занимать 1 г сухого полисахарида после набухания. Для сефадекса G-25 эта величина составляет (в среднем 5). Объем колонки следует разделить на удельный объем сефадекса. Полученная величина укажет требующееся количество граммов сухого сефадекса.

Рекомендуемые размеры колонки 1,8X20 см, объем — Чтобы ее заполнить, потребуется 50,8 : 5 = 10,16 сефадекса.

Подготовка сефадекса и заполнение колонки.

Сухой сефадекс суспендируется в большом объеме дистиллированной воды. После осаждения основной массы сефадекса надосадочную жидкость с мельчайшими частицами геля декантируют. Эту операцию отмывки повторяют несколько раз, пока надосадочная жидкость не будет содержать мельчайших частиц. Для отмывки и набухания сефадекса требуется 3 часа.

Колонка представляет собой цилиндрический стеклянный сосуд высотой 20—25 см и диаметром 1,8 см, с краном внизу. В качестве колонки можно использовать широкую бюретку со стеклянным краном. Ее укрепляют строго вертикально в штативе. На дно колонки кладут кусочек стеклянной ваты, на него кружок фильтровальной бумаги, вырезанный по диаметру колонки, и затем

на 1/3 объема колонки наливают фосфатный буфер (pH 6,8). Открывают кран и заполняют узкую нижнюю часть колонки буфером, далее через воронку, по палочке наливают небольшими порциями суспензию сефадекса и заполняют колонку гелем приблизительно на 70% высоты. Показателем правильного заполнения колонки является строго горизонтальная поверхность геля в ней. После заполнения колонки ее уравновешивают фосфатным буфером (pH 6,8) так, чтобы pH раствора на входе и выходе из колонки был одинаковым.

Гельфильтрация.

Для гельфильтрации берут смесь гемоглобина крови с раствором рибофлавина (витамин ).

Реактивы: а) рибофлавин, 0,02%-ный раствор на дистиллированной воде; б) раствор гемоглобина. Берут кровь из ушной вены кролика. Дистиллированной водой ее разводят в отношении 1:9; в) фосфатный буфер (pH 6,8).

Смешивают по 2 мл обоих растворов, полученную смесь вводят в колонку, не нарушая поверхности сефадекса. После того как основная масса смеси заполнит колонку, сверху над колонкой укрепляют стеклянную воронку в пробке, подобранной по диаметру колонки, и через гель пропускают фосфатный буфер для элюции со скоростью вытекания жидкости через колонку 0,5 мл/мин. Фракции элюата собирают по 5 мл в мерные пробирки с помощью коллектора или вручную.

Вначале будут всходить фракции, содержащие гемоглобин (3—6 фракций), затем окраска последующих фракций изменится на желтую в связи с элюцией рибофлавина.

После разделения с помощью гельфильтрации смеси высокомолекулярного вещества гемоглобина и низкомолекулярного рибофлавина колонка снова уравновешивается фосфатным буфером и может быть использована для дальнейшей работы.