Цветные реакции

Биуретовая реакция (реакция Пиотровского). В щелочной среде белки, а также продукты их гидролиза — полипептиды дают фиолетовое или красно-фиолетовое окрашивание с солями меди. Реакция обусловлена наличием пептидных связей. Положительная биуретовая реакция проявляется у соединений, содержащих не менее двух

пептидных групп. Интенсивность окраски зависит от длины пептида и варьирует от сине-фиолетовой до краснофиолетовой и красной.

Биуретовую реакцию дают также аспарагин (амид аспарагиновой кислоты) и аминокислоты гистидин, треонин и серин.

Свое название реакция получила от биурета — соединения, которое образуется при нагревании мочевины. Эта реакция сопровождается отщеплением молекулы аммиака

Комплексной медно-натриевой соли пептидов и белков приписывают следующее строение:

Реактивы: а) раствор яичного белка (без добавления хлористого натрия); б) раствор растительного белка (приготовление — см. с. 6); в) едкий натр, 10%-ный раствор; г) сернокислая медь, 1%-ный раствор.

В одну пробирку наливают 2 мл раствора яичного белка, в другую — столько же растительного, затем в каждую из них прибавляют равный объем раствора едкого натра и по 1—2 капли раствора сернокислой меди. Появляется красно-фиолетовое или сине-фиолетовое окрашивание.

Нингидриновая реакция.

Нингидриновая реакция обусловлена наличием аминокислот, имеющих аминогруппы в a-положении. Белки, полипептиды и аминокислоты образуют с нингидрином соединение синего или сине-фиолетового цвета (при нагревании). Нингидриновая реакция является одной из наиболее чувствительных для обнаружения а-аминогрупп.

Сущность реакции заключается в том, что а-аминокислоты и пептиды, реагируя с нингидрином, подвергаются окислительному дезаминированию и декарбоксилированию:

Восстановленный нингидрин взаимодействует с аммиаком и второй молекулой нингидрина, в результате чего образуется окрашенное соединение (пурпурный Руэманна)

Реактивы: а) раствор белка (без хлористого натрия). Приготовление — см. с. 6; б) глицин, 0,1%-ный водный раствор; в) нингидрин, 0,1%-ный спиртовой раствор. В одну пробирку наливают 1-2 мл раствора глицина, в другую — столько же раствора белка. В обе пробирки добавляют раствор нингидрина (в первую 5—6 капель, во вторую — 10—12), нагревают около минуты. В пробирке с глицином быстро появляется фиолетово-синее или фиолетовое окрашивание, в пробирке с белком окрашивание развивается медленно и имеет красновато-фиолетовый оттенок (или даже желтовато-фиолетовый в случае наличия иминокислоты пролина).

Реакция Лоури.

Это одна из наиболее чувствительных реакций на белки. Ее дают циклические аминокислоты. Реагируя с реактивом Фолина, они образуют комплексы, окрашенные в синий цвет. Интенсивность окраски зависит от концентрации белков, поэтому реакция Лоури может быть использована и для количественного определения.

Реактивы: а) раствор яичного белка для цветных реакций и реакций осаждения (см. с. 6), разведенный дистиллированной водой в 100 раз; б) глицин, 0,02%-ный раствор; в) фенилаланин, 0,02%-ный раствор; г) реактив А: 2%-ный раствор углекислого натрия в 0,1 н растворе едкого натра; д) реактив В: 0,5%-ный раствор сернокислой меди в 1%-ном растворе двузамещенного виннокислого калия или натрия (); с)реактив С: к 50 мл реактива А пипеткой приливают 1 мл реактива В; ж) реактив Фолина: в колбе из термоустойчивого стекла в 700 мл дистиллированной воды растворяют 100 г вольфрамовокислого натрия (вольфрамата натрия, ) и 25 г молибденовокислого натрия (молибдата натрия, ). К раствору приливают 50 мл концентрированной ортофосфорной кислоты (-ной) и 100 мл

концентрированной соляной кислоты после чего к колбе присоединяют обратный холодильник, переносят ее в вытяжной шкаф и кипятят 10 ч, не допуская бурного кипения жидкости. Затем в колбу добавляют 150 г сернокислого лития дистиллированной воды, 5 капель брома и кипятят (без холодильника) в течение 15 мин. для освобождения от избытка брома. После того как раствор остынет до комнатной температуры, его доводят дистиллированной водой до объема 1 л, фильтруют и хранят в склянке темного стекла с притертой пробкой. Реактив ярко-желтого цвета, устойчив при хранении. Перед употреблением готовят рабочий раствор реактива, разводя его дистиллированной водой в отношении 1:1. Концентрация кислоты в растворе должна составлять 1 г-экв. Ее проверяют титрованием 1 н раствором едкого натра (индикатор — фенолфталеин).

В три пробирки вносят соответственно растворы яичного белка, глицина и фенилаланина (по 2,5 мл), добавляют по 5 мл раствора С и оставляют на 10 мин., после чего приливают по 5 мл рабочего раствора реактива Фолина. Через 30 мин. наблюдают окрашивание жидкости: в пробирках с белком и фенилаланином развивается интенсивная синяя окраска, в пробирке с глицином сохраняется желтый цвет реактива.

Ксантопротеиновая реакция.

Характерна для некоторых ароматических аминокислот (фенилаланина, тирозина, триптофана). При нагревании белков и полипептидов с концентрированной азотной кислотой образуется нитросоединение желтого цвета.

Реакция протекает в две стадии. На протяжении первой аминокислота, например тирозин, взаимодействуя с концентрированной азотной кислотой, подвергается нитрованию. При этом образуется динитротирозин (желтого цвета).

Примечание. В зависимости от количества прибавленной азотной кислоты может образоваться и смесь динитро- и нитротирозина.

Во второй стадии продукты нитрования тирозина (ди-нитро- и нитротирозин) реагируют с едким натром или гидроокисью аммония с образованием натриевой или аммонийной соли, имеющей желто-оранжевое окрашивание.

Ксантопротеиновую реакцию, кроме белков, пептидов и циклических аминокислот, дают также многие простые ароматические соединения (бензол, фенол и др.).

Реактивы: а) раствор яичного или растительного белка (приготовление — см. с. 6); б) раствор желатина, -ный; в) азотная кислота, концентрированная; г) натрий едкий, 20%-ный раствор, или аммиак, концентрированный раствор фенол, -ный раствор.

К 2-3 мл раствора фенола осторожно (по стенке пробирки) приливают 1-2 мл концентрированной азотной кислоты. Осторожно нагревают, появляется желтое окрашивание.

В другую пробирку наливают 1-2 мл раствора яичного или растительного белка, прибавляют 8—10 капель концентрированной азотной кислоты и осторожно нагревают. Выпадает осадок, который окрашивается в желтый цвет.

После охлаждения в пробирку осторожно (по стенке) приливают избыток концентрированного раствора аммиака или едкого натра — жидкость принимает оранжевое или желто-оранжевое окрашивание.

Реакцию следует проводить под тягой!

Те же реакции проводят с раствором желатина: желтого окрашивания не наступает, так как желатин не содержит ароматических аминокислот (иногда может появиться очень слабое желтоватое окрашивание, обусловленное примесью других белков).

Реакция Миллона.

С помощью реакции Миллона открывают наличие аминокислоты тирозина. Тирозин образует с реактивом Миллона ртутную соль нитротирозина красного цвета. Эта реакция характерна также почти для всех фенолов.

Реактивы: а) раствор яичного или растительного белка (см. с. 6); б) раствор желатина, 1%-ный; в) фенол, 0,1%-ный раствор; г) реактив Миллона: 40 г ртути растворяют в 57 мл концентрированной азотной кислоты вначале при комнатной температуре, затем слабо подогревая на водяной бане. Раствор разбавляют двумя объемами воды и после отстаивания сливают с осадка.

Все работы производят под тягой!

К 1 мл раствора фенола в пробирке приливают 0,5 мл реактива Миллона осторожно нагревают. Появляется розовое окрашивание.

В пробирку наливают 1-2 мл раствора яичного или растительного белка и 5—6 капель реактива Миллона, осторожно нагревают.

Жидкость окрашивается в красный цвет, и затем выпадает осадок кирпично-красного цвета.

То же проделывают и с раствором желатина: красного окрашивания не наступает или оно проявляется очень слабо (если желатин не очищен от примеси других белков),

Реакции на триптофан.

Триптофан, реагируя в кислой среде с альдегидами, образует окрашенные продукты конденсации. Например, с глиоксиловой кислотой (являющейся примесью к концентрированной уксусной кислоте) реакция протекает по уравнению

По аналогичной схеме протекает также реакция триптофана с оксиметилфурфуролом или формальдегидом.

В указанных реакциях принимает участие серная кислота, являющаяся водоотнимающим средством.

Реакция Адамкевича. Реактивы: а) свежий яичный белок (неразбавленный); б) желатин, 1%-ный раствор; в) уксусная кислота, концентрированная; г) серная кислота, концентрированная.

В пробирку наливают несколько капель неразбавленного яичного белка, прибавляют 1-2 мл концентрированной уксусной кислоты (лучше ледяной) и осторожно нагревают до растворения выпавшего осадка, после чего охлаждают и (осторожно!) по стенке пробирки, наклонив ее, наслаивают 1 мл концентрированной серной кислоты, следя, чтобы не произошло смешения жидкостей. На границе двух слоев через некоторое время появляется красно-фиолетовое кольцо.

Эту же реакцию проделывают с раствором желатина — окрашивания не наступает, так как триптофан не входит в состав желатина.

Реакция с оксиметилфурфуролом (Шульце — Распайля). От фруктозы в присутствии концентрированной серной кислоты отщепляется три молекулы воды, она превращается в оксиметилфурфурол, который образует с триптофаном окрашенные продукты конденсации. Реакцию можно производить как с фруктозой, так

и с сахарозой, при гидролитическом расщеплении которой освобождаются равные количества глюкозы и фруктозы.

Реактивы: а) раствор яичного или растительного белка (приготовление — см. с. 6); б) сахароза, 5%-ный раствор; в) серная кислота, концентрированная.

К 1-2 мл раствора белка добавляют 2—4 капли раствора сахарозы и по стенке пробирки осторожно наслаивают 1 мл концентрированной серной кислоты. На границе жидкостей появляется кольцо темно-красного (вишневого) цвета.

Реакция с формальдегидом. Реактивы: а) раствор яичного или растительного белка; б) формалин, 5%-ный раствор; в) серная кислота, концентрированная.

К 1 мл раствора белка в пробирке добавляют 2 капли раствора формалина и затем осторожно (по стенке пробирки) наслаивают 1 мл концентрированной серной кислоты, следя, чтобы жидкости не перемешивались. На границе соприкосновения жидкостей появляется кольцо фиолетового или фиолетово-красноватого цвета.

Реакция на аргинин (Сакагучи).

Производные гуанидина, как, например, аминокислота аргинин (гуанидина-миновалериановая кислота), метилгуанидин, гликоциамин (гуанидинуксусная кислота), реагируя с гипобромитом натрия (NaBrO) и а-нафтолом, образуют продукт конденсации кирпично-красного или малинового цвета. Метилгуанидин и глнкоциамин не входят в состав белковых веществ, и поэтому реакцию Сакагучи можно использовать для открытия аминокислоты аргинина.

Гипобромит является окислителем. Окисленный аргинин,

потеряв одну иминогруппу реагирует с а-нафтолом с образованием окрашенного соединения.

Реактивы: а) раствор яичного или растительного белка; б) а-нафтол. Готовят 1%-ный раствор в 96%-ном этиловом спирте. Перед употреблением 10 мл раствора разбавляют спиртом в мерной колбе емкостью натр едкий, 15%-ный раствор; г) раствор гипобромита натрия. 150 г едкого натра добавляют небольшими порциями к 500 мл воды, перемешивают до полного растворения (осторожно: растворение сопровождается обильным выделением теплоты!). К остывшему раствору осторожно (под тягой!) прибавляют при постоянном перемешивании 8 мл чистого брома. Раствор сохраняют в темной склянке с притертой пробкой (в вытяжном шкафу). Срок годности до трех месяцев.

Примечание. Раствор гипобромита натрия готовится лаборантом.

К 1 мл раствора белка прибавляют 2—3 капли раствора едкого натра, капли раствора а-нафтола и хорошо перемешивают, после чего в пробирку добавляют 1—2 капли раствора гипобромита. Появляется малиновокрасное окрашивание.

Реакция на аминокислоты, содержащие серу (цистеин, цистин).

Известны три серусодержащие аминокислоты: цистеин, цистин и метионин.

В молекулах цистеин а и цистин а сера связана относительно слабо и легко отщепляется при щелочном гидролизе в виде сероводорода, который реагирует со щелочью, образуя сульфиды натрия или калия. Сульфиды взаимодействуют с уксуснокислым свинцом (вернее, с плюмбитом) с образованием осадка сернистого свинца черного или буро-черного цвета. Реакции протекают по следующим уравнениям:

Реактивы: а) раствор яичного или растительного белка (см. с. 6); б) желатин, 1%-ный раствор; в) едкий натр, 15-20%-ный раствор; г) уксуснокислый свинец, 1%-ный раствор.

В одну пробирку наливают 2 мл раствора яичного или растительного белка, в другую — столько же раствора желатина. В обе пробирки добавляют по 1-1,5 мл раствора щелочи и осторожно нагревают до кипения, кипятят 1—2 мин., после чего в каждую пробирку прибавляют по 2—3 капли раствора уксуснокислого свинца.

В пробирке с яичным (или растительным) белком появляется буровато-черное или черное окрашивание, интенсивность которогозависит от концентрации раствора белка и содержания в нем цистеина и цистина. Раствор желатина окрашивания не дает. Это свидетельствует о том, что в состав желатина не входят серусодержащие аминокислоты.