29.10. Эукариотическая ДНК содержит много повторяющихся последовательностей оснований

Рой Бриттен (Roy Britten) и его сотрудники исследовали кинетику реассоциации ДНК, денатурированной нагреванием, и обнаружили, что эукариотическая ДНК в отличие от прокариотической ДНК содержит много повторяющихся последовательностей оснований. В этих экспериментах ДНК дробили на короткие фрагменты и затем денатурировали нагреванием раствора выше температуры плавления Затем полученный раствор одноцепочечной ДНК охлаждали до температуры примерно на 25°С ниже оптимальной для реассоциации комплементарных цепей с образованием двухспиральной ДНК. Кинетику реассоциации можно регистрировать самыми различными способами. Один из методов состоит в измерении поглощения раствора при (разд. 24.9). При этой длине волны коэффициент поглощения двухцепочечной ДНК примерно на 40% ниже, чем соответствующая величина для одноцепочечной ДНК; это явление называется гипохромизмом. В основе другого экспериментального подхода лежит тот факт, что двухцепочечная ДНК связывается колонками с гидроксиапатитом (фосфатом кальция), а одноцепочечная проскакивает. В этом методе привлекает то, что он позволяет фракционировать большие количества ДНК на основе скорости ее реассоциации после тепловой денатурации.

Наблюдаемая кинетика реассоциации ДНК Е. coli или фага Т4 соответствует ожидаемой кинетике бимолекулярной реакции

Рис. 29.17. Кривые зависимости от отображают кинетику реассоциации нескольких денатурированных нагреванием ДНК. По оси ординат отложена доля одноцепочечных молекул, по оси абсцисс Быстрая реассоциация сателлитной ДНК мыши показывает, что она содержит огромное количество повторяющихся последовательностей. [Britten R. J., Koh-ne D. E., Science, 161, 530 (1968).]

где комплементарные одноцепочечные молекулы, реассоциировавшая двойная спираль и к - константа скорости ассоциации. В такой реакции доля одноцепочечных молекул снижается со временем в соответствии с уравнением

где исходная концентрация ДНК (выраженная в молях нуклеотидов в время в секундах. Для определенной ДНК и заданных экспериментальных условий (т. е. ионной силы, температуры, размера фрагментов зависит только от произведения концентрации ДНК на время. Кинетику реассоциации удобно графически изображать, откладывая зависимость от десятичного логарифма Такая кривая имеет сигмоидную форму (рис. 29.17). Характеристикой того или иного препарата ДНК служит величина которую легко определить с помощью этой кривой. значение при котором происходит реассоциация половины Для ДНК Е. coli значение составляет примерно для фага Эти числа показывают, что ДНК Е. coli реассоциирует примерно в 30 раз медленнее, чем ДНК фага Т4. Объясняется это тем, что ДНК Е. coli длиннее и число разных видов фрагментов, которые содержатся в препарате ДНК, разрушенной силами сдвига, больше, чем в препарате Итак, концентрация комплементарных фрагментов в растворе фрагментированной ДНК Е. coli ниже, чем в растворе ДНК фага Т4 (содержащем такое же количество нуклеотидов), и, следовательно, скорость реассоциации ниже. Исследование ряда прокариотических ДНК показало, что величина прямо пропорциональна размеру генома.

Когда с помощью этого метода стали исследовать ДНК мыши, получили неожиданный результат. Геномы млекопитающих примерно на три порядка величины больше, чем геном Е. coli, и предполагалось, что будет получена величина порядка Раствор ДНК с концентрацией и с такой величиной должен реассоциировать наполовину за 108 с (примерно 3 года). К удивлению исследователей, они обнаружили, что 10% ДНК мыши реассоциирует наполовину за несколько секунд. Эта фракция ДНК мыши реассоциирует быстрее, чем даже самые маленькие вирусные следовательно, содержит много повторяющихся последовательностей. Анализ

кривой зависимости от показал, что эта фракция мышиной ДНК содержит порядка миллиона копий повторяющейся последовательности длиной около 300 пар оснований. Примерно 20% мышиной ДНК ренатурирует с промежуточной скоростью. Этот факт, согласно интерпретации авторов, указывал, что данная фракция содержит 103—104 копий определенных последовательностей. Остальные 70% мышиной ДНК ренатурировали очень медленно. Величина для этой фракции показывала, что она состоит из уникальных или почти уникальных последовательностей оснований.

Все изученные до настоящего времени эукариотические геномы, кроме, возможно, дрожжей, содержат повторяющиеся последовательности ДНК, тогда как прокариоты ее не содержат. Например, человеческая ДНК на 30% состоит из последовательностей, повторяющихся по меньшей мере 20 раз. Относительное содержание высокоповторяющейся, умеренно повторяющейся и уникальной ДНК различно у разных видов.