33.2. Синтез специфических антител в ответ на антиген

Животные способны синтезировать специфические антитела против практически любой химической группы. Особенно эффективно стимулирует образование антител динитрофенол (ДНФ), и потому его широко используют в качестве гаптенной детерминанты. Антитела против ДНФ получают следующим образом.

1. ДНФ-группы присоединяют ковалентно к белку-носителю, например к альбумину сыворотки быка (БСА), используя взаимодействие фтординитробензола с боковыми цепями лизина или других нуклеофильных остатков белка (рис. 33.4).

2. ДНФ-БСА вводят кролику в качестве иммуногена (антигена). Спустя несколько

Рис. 33.3. Электронная микрофотография плазматической клетки. Виден очень хорошо развитый шероховатый эндоплазматический ретикулум. (Печатается с любезного разрешения L. Mercer.)

Рис. 33.4. Динитрофенильное производное бычьего сывороточного альбумина (ДНФ-БСА) - эффективного антигена.

Рис. 33.5. Кинетика появления иммуноглобулинов в сыворотке после иммунизации.

дней содержание антител против ДНФ-альбумина начинает возрастать (рис. 33.5). Эти первыми появляющиеся антитела принадлежат к классу иммуноглобулинов массой около

3. Спустя примерно 10 дней после введения антигена количество иммуноглобулина начинает уменьшаться, но одновременно растет содержание антител другого класса, а именно иммуноглобулинов массой около

4. Спустя примерно 3 недели после введения антигена содержание анти-ДНФ-антител класса иммуноглобулинов G достигает плато. Введение в этот период новой порции ДНФ-БСА вызывает дальнейшее увеличение содержания антител против ДНФ в сыворотке кролика.

5. Собирают кровь иммунизированного кролика и получают сыворотку (называемую антисывороткой, поскольку она получена после иммунизации). Содержание антител против ДНФ в этой сыворотке может достигать антител в расчете на сыворотки. ДНФ исключительно эффективен как агент, стимулирующий образование больших количеств специфических антител. Почти все эти антитела принадлежат к классу иммуноглобулинов основному классу иммуноглобулинов сыворотки.

6. Следующий этап - отделение антител против ДНФ от антител с другой специфичностью и от прочих сывороточных белков. Антитела против ДНФ отличаются от остальных белков антисыворотки очень выоким сродством к ДНФ. Следовательно, их можно выделить методом аффинной хроматографии. Для этого готовят колонку, содержащую динитрофенильные группы, ковалентно связанные с нерастворимым углеводным носителем. На колонку наносят антисыворотку и затем промывают буферным раствором. Большая часть белков антисыворотки проходит сквозь колонку, поскольку их сродство как к ДНФ-группам, так и к углеводному носителю ничтожно мало или вовсе отсутствует. В то же время антитела против ДНФ прочно связываются на колонке. Далее эти антитела снимают с колонки. Для этого на колонку наносят ДНФ в высокой концентрации: добавленный ДНФ связывается с антителами, вытесняя их из связи с динитрофенильными группами нерастворимого углеводного носителя. Растворимый комплекс, состоящий из ДНФ и антител против ДНФ, выходит с колонки. Далее ДНФ удаляют путем диализа или ионно-обменной хроматографии, и в результате остается препарат очищенных антител.