24.29. Полная последовательность оснований ДНК фага фХ174 была определена с помощью метода ферментативной репликации
Другой метод определения последовательности оснований в ДНК основан на образовании меченых фрагментов с помощью контролируемого прерывания ферментативной репликации in vitro. Этот метод разработали Фред Сэнгер (Fred Sanger) и его сотрудники. Для считывания определенной последовательности с одноцепочечной ДНК используют ДНК-полимеразу
Рис. 24.52. На радиоавтографе геля видны меченые фрагменты, образовавшиеся при химическом расщеплении. 
-конец этой ДНК был помечен 
Самый короткий нуклеотид расположен у основания геля. С геля можно прочитать последовательность 
1. В качестве затравки для синтеза используется комплементарный фрагмент, который можно получить из набора продуктов рестрикции, соответствующей двухцепочечной ДНК. Кроме четырех радиоактивных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, инкубационная смесь содержит 
-дидезоксианалог одного из них. Включение этого аналога блокирует дальнейший рост цепи, так как он не содержит концевой 3-гидроксильной группы, необходимой для образования следующей фосфодиэфирной связи. Так образуются фрагменты, несущие на 3-конце дидезоксианалог (рис. 24.53). Затем четыре набора фрагментов, образованных терминированием цепей, разделяют гель-электрофорезом и прочитывают последовательность оснований синтезированной ДНК по радиоавтографу геля. Используя менее 1 пмоль очищенной ДНК, можно определить последовательности 200 нуклеотидов.
С помощью метода контролируемой репликации in vitro Сэнгер определил полную последовательность 5375 оснований в ДНК фага 
Расшифровка последовательности ДНК целого генома - крупное достижение молекулярной биологии. Она позволила сделать ряд важных выводов, которые мы рассмотрим в гл. 26 (разд. 26.11). Интересно отметить, что Сэнгер определил полную последовательность оснований целого генома через четверть века после того, как он расшифровал аминокислотную последовательность белка.
Заключение
ДНК - молекула наследственности у всех прокариотических и эукариотических организмов. У вирусов роль генетического материала выполняет либо ДНК, либо РНК. Любая клеточная ДНК представляет собой две очень длинные спиральные полинуклеотидные цепи, закрученные вокруг общей оси. Две цепи двойной спирали ориентированы в противоположном направлении (антипараллельны). Сахарофосфатный остов каждой цепи лежит снаружи двойной спирали, а пуриновые и пиримидиновые основания - внутри. Две цепи удерживаются вместе водородными связями между парами оснований. Аденин (А) всегда спаривается с тимином (Т), а гуанин (G) - c цитозином (С). Таким образом, цепи двойной спирали взаимно комплементарны. Генетическая информация закодирована в последовательности оснований вдоль цепи. Большинство молекул ДНК имеет
Рис. 24.53. Стратегия метода определения последовательности нуклеотидов в ДНК путем терминирования цепи. Фрагменты образуются в результате добавления 
-дидезоксианалога одного из dNTP в каждую из четырех пробирок, в которых происходит полимеризация. Например, при добавлении дидезоксианалога dATP образуются фрагменты, оканчивающиеся на А (показано красным цветом).
кольцевую форму. Ось двойной спирали кольцевой ДНК может сама закручиваться и образовывать суперспираль. Суперспирализованная ДНК имеет более компактную форму, чем релаксированная ДНК.
При репликации ДНК две цепи двойной спирали расплетаются и расходятся по мере того, как синтезируются новые цепи. Каждая родительская цепь служит матрицей для образования новой комплементарной цепи. Таким образом, репликация ДНК полуконсервативна - каждая дочерняя молекула получает одну цепь родительской молекулы ДНК. Репликация ДНК - сложный процесс, в осуществлении которого участвует много белков, в том числе ДНК-полимеразы трех типов и ДНК-лигаза. Активированные предшественники синтеза ДНК - четыре дезоксирибонуклеозид-5-трифосфаты. Новая цепь синтезируется в направлении 
Этот синтез осуществляется путем нуклеофильной атаки внутреннего атома фосфора очередного дезоксинуклеозидтрифосфата 3-гидроксильным концом цепи затравки. Самое важное состоит в том, что ДНК-полимераза катализирует образование фосфодиэфирной связи только в том случае, если основание очередного нуклеотида комплементарно основанию матричной цепи. Другими словами, ДНК-полимеразы — ферменты, направляемые матрицами. ДНК-полимеразы I, II и III обладают также 
-экзонуклеазной активностью, которая увеличивает надежность репликации путем удаления некомплементарных остатков. ДНК-полимеразам I и III присуща, кроме того, 
-нуклеазная активность, играющая важную роль в механизмах репликации и репарации ДНК.
Репликация ДНК в клетках E. coli начинается в строго определенном месте (в точке начала репликации) и идет в обоих направлениях. В области репликационной вилки (там, где из двух цепей ДНК получаются четыре) обе цепи родительской ДНК используются в качестве матриц для синтеза новой ДНК. Белок rep расплетает родительскую ДНК за счет энергии гидролиза АТР. Расплетанию способствует также ДНК-гираза, которая играет роль молекулярного шарнира и вводит отрицательные супервитки в родительскую ДНК. Одна цепь ДНК (ведущая) синтезируется непрерывно, тогда как другая (отстающая) синтезируется в виде фрагментов длиной 
Поскольку образование отстающей цепи происходит путем сборки из отдельных фрагментов, полимеризация в направлении 
на атомном уровне приводит к общему росту этой цепи в направлении 
Синтезу новой ДНК предшествует синтез РНК, которая используется затем в качестве затравки. Впоследствии РНК, входящая в состав новообразованной РНК-ДНК-цепи, гидролизуется и замещается ДНК. Затем ДНК-лигаза соединяет новообразованные фрагменты ДНК, которые спарены с одной и той же матричной цепью. В этой реакции участвует в качестве источника энергии NAD+.
Повреждения в ДНК, вызванные ионизирующей радиацией, ультрафиолетовым светом и различными химическими соединениями, постоянно репарируются. Например, пиримидиновые димеры, индуцированные ультрафиолетовым светом, вырезаются специфической эндонуклеазой. Урацил, который образуется при спонтанном дезаминировании цитозина в ДНК, удаляется гликозидазой, которая дифференцирует урацил и тимин.
Ферменты рестрикции узнают специфические последовательности, обладающие симметрией второго порядка, и гидролизуют одну фосфодиэфирную связь в каждой цепи ДНК в этой области. Эти эндонуклеазы можно использовать для расщепления молекул ДНК на специфические фрагменты, удобные для дальнейшего изучения. Разработка методов, позволяющих быстро определять последовательность нуклеотидов в ДНК на основе специфического расщепления и электрофоретического разделения продуктов, революционизировала изучение структуры ДНК.
