26.6. Еще один инструмент расшифровки кода - сополимеры с определенной последовательностью

Примерно в то же время Гобинду Коране (Gobind Khorana) удалось синтезировать полирибонуклеотиды с определенной повторяющейся последовательностью. Сочетая методы органической химии и ферментативные методы, он синтезировал ряд сополимеров с повторяющейся последовательностью из двух, трех и четырех оснований. Рассмотрим, к примеру, стратегию синтеза Этот упорядоченный сополимер имеет последовательность

Прежде всего Корана синтезировал с помощью методов органической химии два комплементарных дезоксирибонуклеотида по девять нуклеотидов длиной: Затем эти два олигонуклеотида были использованы в качестве матрицы для синтеза длинных цепей ДНК из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов под действием ДНК-полимеразы Ни один олигонуклеотид в отдельности не был эффективной матрицей. Если же присутствовали оба олигонуклеотида, то служил матрицей для синтеза для синтеза Эти длинные комплементарные ДНК образовывали двухспиральные молекулы. Следующим шагом было получение длинных

Рис. 26.4. Цепь этой двухспиральной матричной ДНК, которая должна транскрибироваться, определяется набором рибонуклеозидтрифосфатов в инкубационной смеси.

полирибонуклеотидных цепей с последовательностью, соответствующей Для этого дуплекс использовали в качестве матрицы для РНК-полимеразы. Цепь ДНК для транскрипции можно выбрать, добавляя три подходящих рибонуклеозидтрифосфата. Если в инкубационную смесь добавить и на матричной цепи синтезируется полирибонуклеотидный продукт Другая цепь не транскрибируется, так как не хватает одного из необходимых субстратов - СТР. Если же добавить и АТР, то на другой матричной цепи синтезируется Итак, органический синтез и вслед за ним матричный синтез с помощью ДНК-полимеразы и РНК-полимеразы позволили синтезировать два длинных полирибонуклеотида со строго определенной повторяющейся последовательностью оснований (рис. 26.4).

Эти регулярные сополимеры были использованы в качестве матриц в бесклеточной системе синтеза белка. Рассмотрим некоторые результаты такого эксперимента. Сополимер, состоящий из чередующейся последовательности двух оснований - А и Б:

содержит кодоны двух видов - и Поэтому полипептидный продукт должен представлять собой чередующуюся последовательность из двух аминокислот (сокращенно обозначенных

Стоит ли на N-конце полипептидного продукта или зависит от того, начинается ли рамка считывания с А или с Если в качестве матрицы использовали то синтезировался полипептид из чередующихся валина и цистеина

Этот результат однозначно доказывал триплетность кода и показывал, что один из триплетов - или кодирует цистеин, а другой - валин. В сочетании с данными по связыванию тРНК было очевидно, что кодирует цистеин, валин. В присутствии некоторых чередующихся сополимеров из двух оснований происходил синтез следующих полипептидов:

Рассмотрим теперь матрицу, состоящую из повторяющейся последовательности трех оснований, Если рамка считывания начинается с А, образующийся полипептид должен содержать аминокислоту только одного вида, кодируемую триплетом

Если рамка считывания начинается с синтезирующийся полипептид должен содержать другую аминокислоту, кодируемую триплетом

Если же рамка считывания начинается с В, должен образовываться полипептид третьего типа, содержащий аминокислоту, кодируемую триплетом

Таким образом, предполагаемые продукты - три различных гомополипептида. Действительно, именно такой результат получался в случае большинства матриц, состоящий из повторяющейся последовательности трех нуклеотидов. Например, на синтезировались полифенилаланин, полисерин и полилейцин. Этот результат в сочетании с результатами других экспериментов показывал, что кодирует фенилаланин, -серин и -лейцин. Полипептиды, которые синтезировались на других матрицах этого типа, приведены в табл. 26.3. Обратите внимание, что в присутствии происходил синтез двух, а не трех гомополипептидов.

Таблица 26.3. (см. скан) Гомополнпептнды, синтезирующиеся на матрицах, которые состоят из повторяющихся последовательностей тринуклеотидов

Причина этого явления станет ясна чуть ниже.

Корана синтезировал также ряд сополимеров, состоящих из повторяющегося тетрануклеотида, например На этой матрице шел синтез полипептида с повторяющейся последовательностью независимо от рамки считывания:

Отсюда можно было сделать вывод о смысле четырех кодонов.

Совершенно иной результат был получен при использовании в качестве матрицы Единственными продуктами были и трипептиды. Почему не было более длинных цепей? Объясняется это тем, что один из триплетов, встречающихся в этом сополимере, а именно кодирует не аминокислоту, а терминацию синтеза белка:

На матрице также получались только ди- и трипептиды, так как второй сигнал терминации цепи:

Посмотрим теперь снова на табл. 26.3. На матрице синтезировались два, а не три гомополипептида по той причине, что третья рамка считывания соответствует последовательности

т. е. представляет собой повторяющуюся последовательность сигнала терминации. Как же обстоит дело с На этой матрице синтезировались только два гомополипептида, потому что третья рамка считывания соответствует еще одному сигналу терминации -

Таблица 26.4. (см. скан) Генетический код

В действительности оказалось, что только три кодона не кодируют никакой аминокислоты: UAG, UAA и UGA.

Синтез полинуклеотидов с определенной последовательностью в лаборатории Кораны был выдающимся достижением. Использование этих полимеров в качестве матриц для синтеза белка в сочетании с работами Ниренберга по связыванию тРНК с рибосомами в присутствии тринуклеотидов привели к полной расшифровке генетического кода к 1966 г. Еще за шесть лет до этого такое событие казалось несбыточной мечтой. Благодаря разработке совершенных методов синтеза в лаборатории Кораны стало возможным и еще одно достижение: полный синтез молекулы ДНК, соответствующей последовательности молекулы транспортной РНК.