31.10. Плазмиды и фаг лямбда - наиболее подходящие векторы для клонирования ДНК в бактериях

Для увеличения эффективности проникновения рекомбинантных ДНК в клетку и облегчения отбора содержащих такие молекулы бактерий создаются новые векторы. Например, плазмида содержит гены устойчивости к тетрациклину и ампициллину (сходный с пенициллином антибиотик). Эту плазмиду пять различных рестриктаз расщепляют в каком-то одном определенном месте каждая (рис. 31.22). Введение ДНК в участок рестрикции не затрагивает генов устойчивости к антибиотикам. В то же время введение ДНК в участки рестрикции или приводит к инактивации гена устойчивости к тетрациклину; это явление называется инактивацией вставкой (инсерционной инактивацией). Клетки, содержащие со вставленной ДНК, устойчивы к ампициллину, но чувствительны к тетрациклину; поэтому их легко отобрать. Клетки, которые не смогли воспринять ДНК вектора, чувствительны к обоим антибиотикам, а клетки, содержащие без вставки ДНК, к обоим антибиотикам устойчивы.

Другая группа векторов создана на основе плазмиды ColE1, кодирующей колицин Е - белковый токсин, убивающий некоторые штаммы Е. coli. Преимущество использования этих колициногенных плазмид в качестве

Рис. 31.22. Генетическая карта плазмиды несущей два гена устойчивости к антибиотикам.

Рис. 31.23. Электронная микрофотография плазмид ColE1. (Печатается с любезного разрешения д-ра Jack Griffith.)

векторов состоит в том что их репликация не находится под строгим контролем. В клетке, содержащей ColE1, обычно имеется 25 копий плазмиды. Обработка клеток хлорамфениколом блокирует синтез белка и репликацию клеточной хромосомы. Однако репликация ColE1 в этих условиях продолжается. В результате в клетках, обработанных хлорамфениколом, может накапливаться 1000 копий ColE1, так что количество этой плазмиды достигает примерно половины всей клеточной ДНК.

Фаг X - другой удобный вектор. Большие участки его ДНК, имеющей в длину не являются необходимыми для литической инфекции или интеграции и могут быть замещены чужеродной ДНК. Были сконструированы мутантные фаги X, предназначенные для клонирования ДНК. Один из этих мутантов, который называется содержит два участка расщепления вместо пяти, имеющихся в фаге дикого типа (рис. 31.24). После расщепления центральный участок молекулы ДНК этого фага X можно удалить. Два оставшихся куска ДНК составляют вместе 72% длины всего генома. Это количество ДНК недостаточно для упаковки в головку фага Длина ДНК, которая может быть легко упакована в головку, достигает 75-105% длины генома дикого типа. Однако достаточно длинный фрагмент ДНК (скажем, длиной вставленный между двумя концами ДНК фага X, позволяет такой рекомбинантной молекуле ДНК (93% генома) быть упакованной в головке (инкапсидироваться). Почти все инфекционные частицы X, образованные таким способом, будут содержать вставленный кусок чужеродной ДНК. Еще одно преимущество использования этих вирионов в качестве векторов состоит в том, что они проникают в бактерии с гораздо более высокой эффективностью, чем плазмиды. К настоящему времени разработаны методы упаковки молекул ДНК in vitro с образованием инфекционных вирионов Для использования в качестве векторов были сконструированы самые разнообразные мутанты фага Некоторые из них могут служить векторами для вставок фрагментов ДНК, достигающих