25.12. сигма-Субъединица обеспечивает узнавание промоторных участков РНК-полимеразой

Корфермент РНК-полимеразы не может начинать транскрипцию в промоторных участках. Для специфической инициации необходим голофермент Роль сигма-субъединицы была открыта следующим образом. Если РНК-полимеразу очищали хроматографией на колонке с фосфоцеллюлозой, то она была

Рис. 25.13. Промоторные последовательности лактозного галактозного (Б) и триптофанового (В) оперонов E.coli, фагов и и вируса Предполагаемая область гомологии, так называемая последовательность Прибнова (Pribnow), показана зеленым.

Рис. 25.14. Разделение РНК-полимеразы на -субъединицу и корфермент (минимальный фермент; на колонке с фосфоцеллюлозой.

практически лишена активности при использовании в качестве матрицы ДНК фага Т4, но сохраняла активность в опытах с ДНК из тимуса теленка. Наряду с этим та же РНК-полимераза, очищенная центрифугированием в градиенте концентрации глицерола, была, напротив, весьма активна на обеих матрицах. Из этого наблюдения можно было сделать вывод, что в препарате РНК-полимеразы, очищенной на фосфоцеллюлозе, не хватает какого-то фактора. Так оно и было (рис. 25.14). Активность фермента, очищенного на фосфоцеллюлозе, значительно увеличивается при добавлении другой фракции, элюирующейся с колонки. Этот стимулирующий фактор сам по себе не обладает каталитической активностью. Он был назван сигма фактором. Последующие эксперименты показали, что фермент, очищенный на фосфоцеллюлозе, лишен -субъединицы, тогда как фермент, очищенный в глицероле, содержит ее. Таким образом, препарат, проявлявший максимальную активность при использовании в качестве матрицы ДНК фага Т4, представлял собой голофермент а корфермент был не в состоянии транскрибировать эту ДНК. Добавление -субъединицы к корферменту приводило к реконструкции вполне активного голофермента. Корфермент обладал способностью транскрибировать ДНК тимуса теленка, так как эта матрица содержит много одноцепочечных разрывов. РНК, синтезированная корполимеразой не соответствует транскриптам, образующимся in vivo. В частности, корфермент транскрибирует обе цепи фаговых ДНК-матриц, тогда как голофермент транскрибирует асимметрично одну цепь, как он это делает in vivo.

Сигма-субъединица обеспечивает специфическую инициацию, снижая в 10 раз сродство РНК-полимеразы к ДНК, не содержащей промоторов. Кроме того, сигма-субъединица активирует узнавание промоторных последовательностей РНК-поли-меразой. Наконец, сигма-субъединица участвует в раскрывании двойной спирали ДНК, так чтобы одна из цепей могла служить матрицей. При связывании голофермента РНК-полимеразы расплетается примерно один виток спирали ДНК. Так происходит подготовка фермента к образованию первой фосфодиэфирной связи новой цепи РНК.

После того как начинается синтез новой цепи РНК, сигма-субъединица отделяется от голофермента. Корфермент продолжает транскрибировать матрицу ДНК. Таким образом, функция голофермента — поиск промотора и инициация, а функция корфермента - элонгация. Отделившаяся сигма-субъединица присоединяется к другой молекуле корполимеразы, чтобы участвовать в инициации нового цикла транскрипции.

Инициация новых цепей РНК регулируется многими способами. Некоторые промоторные последовательности обеспечивают высокую эффективность инициации, другие менее эффективны. Кроме того, эффективность инициации регулируется белками, которые связываются с самим промоторным участком или рядом с ним. Репрессоры блокируют транскрипцию, препятствуя связыванию РНК-полимеразы, а факторы положительной регуляции способствуют инициации, облегчая связывание РНК-полимеразы. Эти важные регуля-торные механизмы мы рассмотрим подробнее в гл. 28.