24.16. Открытие ДНК-полимераз II и III

Мы видели, что ДНК-полимераза I может синтезировать и репарировать ДНК in vitro. Выполняет ли она эти функции in vivo? Вопрос вполне правомерный, так как фермент не всегда способен осуществлять in vivo ту реакцию, которую он катализирует in vitro. Условия, существующие в клетке, могут отличаться от условий, используемых при постановке опытов in vitro, и, кроме того, в клетке могут присутствовать другие ферменты. Действительно, в клетке E.coli имеются по меньшей мере две другие ДНК-полимеразы, названные полимеразами II и III, которые были обнаружены примерно через 15 лет после открытия ДНК-полимеразы Чем же объясняется такое запаздывание? Дело в том, что активность ДНК-полимераз II и III маскировалась высокой активностью полимеразы

Ситуация изменилась в 1969 г., когда Паула Де Лусия и Джон Кэрнс (Paula DeLucia, John Cairns) выделили мутантную форму E.coli, в экстракте которого обнаруживалось от 0,5 до 1% нормальной полимеразной активности ДНК-полимеразы I по сравнению с обычными клетками. Этот мутант (обозначенный размножался с такой же скоростью, как и родительский штамм. Кроме того, многие фаги размножались в клетках polA 1 так же хорошо, как и в родительских клетках. Однако этот мутант гораздо быстрее погибал под действием ультрафиолетового облучения. К тому же мутант polA 1 был более чувствителен к летальному действию химического мутагена метилметансульфоната. Де Лусия и Кэрнс сделали вывод, что репликация ДНК в клетках полученного ими мутанта polA 1 идет нормально, но репарация ДНК существенно нарушена. Они предположили, что для синтеза ДНК нужна какая-то другая полимераза, отличная от ДНК-полимеразы

Низкий фон активности полимеразы I у мутанта polA 1 облегчил поиск новых ДНК-полимераз. Вскоре в нескольких лабораториях были выделены и охарактеризованы два таких фермента. ДНК-полимеразы II и III подобны полимеразе I в следующих отношениях:

1. Они катализируют направляемый матрицей синтез ДНК из предшественников дезоксирибонуклеозидтрифосфатов.

2. Для проявления их активности необходима затравка со свободной 3-ОН-группой,

3. Синтез идет в направлении

4. Они обладают -экзонуклеазной активностью. ДНК-полимераза III (но не II) является также -нуклеазой.

Эти полимеразы различаются по характеру предпочитаемых ими матриц. Для полимераз II и III оптимальными матрицами служат двухцепочечные ДНК, имеющие короткие одноцепочечные пробелы. Полиме-раза I, наоборот, предпочитает протяженные одноцепочечные участки, соседствующие с двухспиральными участками. Максимальные скорости катализа in vitro для этих ферментов также различаются: по-лимераза I присоединяет 10 нуклеотидов в секунду, а полимераза II - 0,5 и полимераза

III - 150 нуклеотидов в секунду. В физиологически активном состоянии ДНК-полимераза III ассоциирована с некоторыми другими белками. Этот мультисубъединичный комплекс называют голоферментом ДНК-полимеразы III.

Какова роль этих полимераз in vivo? Вскоре мы расскажем о том, что мультиферментный комплекс, содержащий ДНК-полимеразу III, синтезирует большую часть новообразующейся ДНК, а ДНК-полимераза I удаляет затравку и заполняет пробелы. Роль ДНК-полимеразы II пока не установлена. Проведенные в последнее время

Рис. 24.33. Положение структурных генов трех ДНК-полимераз Е. coli. Ген ДНК-полимеразы I расположен в локусе polA, ген ДНК-полимеразы II - в локусе polB и ген ДНК-полимеразы III - в локусе

биохимические и генетические исследования показали, что, кроме ДНК-полимераз I и II и ДНК-лигазы, для репликации ДНК в клетке E.coli необходимо более 10 белков. Прежде чем рассмотреть взаимодействие этих белков с ДНК, познакомимся в общих чертах с репликацией на уровне целой хромосомы.