35.9. Препроинсулин и проинсулин - предшественники активного гормона
Как показал Фредерик Сангер (Frederik Sanger), бычий инсулин состоит из двух цепей: А-цепи из 21 аминокислотного остатка и 
-цепи из 30 остатков; цепи инсулина ковалентно связаны между собой двумя дисульфидными мостиками (рис. 35.9).
Рис. 35.9. Полипептидные цепи и дисульфидные мостики в инсулине.
Рис. 35.10. Изучение белка с высокой радиоактивностью, выявляемой после импульсного введения метки в аденому островковой ткани поджелудочной железы, привело к открытию проинсулина (непрерывной линией показана радиоактивность, прерывистой - оптическая плотность при 280 нм).
Аналогичное строение имеют инсулины других видов животных, в том числе человека. Как синтезируется этот двухцепочечный белок? A priori можно предположить, что А- и В-цепи синтезируются по отдельности, затем они специфически связываются в результате нековалентных взаимодействий и далее между ними формируются правильно расположенные дисульфидные мостики. Такое предположение было проверено экспериментально; для этого определяли, можно ли из восстановленных А- и В-цепей получить in vitro активный гормон с правильным расположением дисульфидных мостиков. Стимулом для этого исследования послужили данные Анфинсена (Anfinsen), посвященные рибонуклеазе - одноцепочечному белку, способному к полной ренатурации после химического восстановления и развертывания структуры (разд. 2.12). Однако в случае инсулина был получен совершенно иной результат: менее 4% образованных in vitro молекул содержали правильные дисульфидные пары. Такой же низкий выход ренатурированного белка имел место и в случае с химотрипсином - трехцепочечным ферментом, имеющем две межцепочечные дисульфидные связи (разд. 8.2). С другой стороны, химотринсиноген - одноцепочечный
Рис. 35.11. Последовательность аминокислот в проинсулине свиньи; А-цепь инсулина показана красным цветом, В-цепь - синим, связующий пептид (С-пеп-тид) - желтым. [Chance R.E., Ellis R.M., Bromer W.W.. 
предшественник химотрипсина - восстанавливал свою структуру в значительно большей мере. Различие в поведении химотрипсина и химотрипсиногена наводило на мысль о том, что и инсулин не восстанавливал структуры должным образом из-за частичного отсутствия необходимой для этого информации. Возник вопрос, не является ли инсулин, подобно химотрипсину, производным одной полипептидной цепи?
Решающую роль в изучении этой проблемы сыграла работа Доналда Стайнера (Donald Steiner), проведенная на аденоме островковой ткани поджелудочной железы. Эта редко встречающаяся опухоль человека продуцирует большие количества инсулина. Стайнер инкубировал срезы опухоли с меченным тритием лейцином и далее проводил анализ. Таким путем был обнаружен новый включавший большое количество метки белок (рис. 35.10). Последующие исследования показали, что этот белок, названный проинсулином, служит предшественником инсулина.
Проинсулин представляет собой единую полипептидную цепь, в которой есть последовательность примерно из 30 аминокислот, отсутствующая в инсулине (рис. 35.11). Это связующий пептид (С-пептид от англ. connecting - связующий); он расположен между карбоксильным концом В-цепи и аминоконцом А-цепи будущего инсулина. Как и предполагалось, проинсулин обладает способностью к формированию правильно расположенных дисульфидных связей после обработки восстанавливающими агентами и последующего повторного окисления.
Недавно проведенные исследования биосинтеза инсулина выявили, что проинсулин - это еще не исходная форма синтезированного гормона. Новообразованная полипептидная цепь, попадающая в просвет шероховатого эндоплазматичсского ретикулума, представляет собой так называемый препроинсулин, который содержит N-концевую последовательность из 16 остатков, отсутствующую в проинсулине. По-видимому, этот N-концевой гидрофобный участок служит сигнальной последовательностью, направляющей новообразованную цепь в эндоплазматический ретикулум (разд. 29.30). Превращение препроинсулина в проинсулин происходит в просвете трубочек эндоплазматического ретикулума вскоре после прохождения препроинсулина через мембрану.
Рис. 35.12. Ферментативное превращение препроинсулина в проинсулин и далее в инсулин.
Далее образовавшийся проинсулин транспортируется в аппарат Гольджи, где начинается протеолиз соединительного пептида. Формирование инсулина из проинсулина (неактивного гормона) продолжается в секреторных гранулах. В проинсулинах животных разных видов С-пептиды имеют общие структурные особенности. Так, во всех изученных к настоящему времени проинсулинах связующий пептид содержит Arg-Arg на N-конце и Lys-Arg на С-конце. Гидролиз полипептидной цепи по этим положительно заряженным остаткам осуществляется протеолитическим ферментом, сходным с трипсином. Секреция инсулина, накопленного в созревших секреторных гранулах, осуществляется при слиянии мембран гранул с плазматической мембраной клетки.
