26.3. Расшифровка генетического кода: синтетические РНК могут служить информационными РНК

Каково соотношение между 64 видами кодовых слов и 20 аминокислотами? В принципе на этот вопрос можно получить прямой ответ, если сравнить последовательность аминокислот в каком-либо белке с соответствующей последовательностью оснований его гена или мРНК. Однако в 1961 г. этот подход был совершенно недоступен, так как о последовательностях оснований в генах и молекулах мРНК ничего не было известно. Тогда казалось, что проблема генетического кода не может быть решена в близком будущем, но внезапно ситуация изменилась. Маршалл

Ниренберг (Marshall Nirenberg) обнаружил, что добавление полиуридилата в бесклеточную систему синтеза белка приводит к синтезу полифенилаланина. Очевидно, выполнил функцию информационной РНК. Первое кодовое слово было расшифровано: UUU кодирует фени-лаланин Этот замечательный эксперимент указал путь к полной расшифровке генетического кода.

Обсудим более подробно этот эпохальный эксперимент. В качестве двух основных компонентов были использованы бесклеточная система, активно синтезировавшая белок, и синтетический полирибонуклеотид, сыгравший роль информационной РНК. Бесклеточная система синтеза белка была получена из Е. coli следующим образом. Бактериальные клетки осторожно разрушали, перемалывая с тонко измельченным порошком окиси алюминия, чтобы получить клеточный сок. Затем обрывки клеточной стенки и клеточной мембраны удаляли центрифугированием. В результате получали экстракт, содержащий ДНК, мРНК, тРНК, рибосомы, ферменты и другие клеточные компоненты. При добавлении ATP, GTP и аминокислот в этой бесклеточной системе синтезировался белок. По крайней мере одна из добавленных аминокислот была радиоактивной, что давало возможность обнаружить ее включение в белок. Эту смесь инкубировали при 37°С примерно в течение Затем добавляли трихлоруксусную кислоту, чтобы остановить реакцию и осадить белки. При этом свободные аминокислоты оставались в надосадочной фракции. Осадок промывали и просчитывали его радиоактивность, определяя таким образом сколько меченой аминокислоты включилось в новосинтезированный белок. Важная особенность этой системы состоит в том, что синтез белка можно остановить добавлением дезоксирибонуклеазы, разрушающей матрицы для синтеза новых мРНК. Поскольку та мРНК, которая уже имелась в смеси ко времени добавления дезоксирибонуклеазы, лабильна, синтез белка можно прекратить в течение нескольких минут. Затем Ниренберг обнаружил, что синтез белка возобновляется при добавлении неочищенной фракции мРНК. Таким образом, в руках Ниренберга была бесклеточная система синтеза белка, зависящая от добавления мРНК.

Другим важнейшим компонентом в этом эксперименте был синтетический полирибонуклеотид синтезировали с помощью полинуклеотид-фосфорилазы - фермента, открытого в 1955 г. Марианной Грюнберг-Манаго и Северо Очоа (Marianne Grunberg-Manago, Severo Ochoa). Этот фермент катализирует синтез полирибонуклеотидов из рибонуклеозиддифосфатов:

Полинуклеотид-фосфорилаза и РНК-полимераза катализируют совершенно различные реакции. В приведенной реакции активированными предшественниками служат рибонуклеозиддифосфаты, а не трифосфаты. Продукт реакции - ортофосфат, а не пирофосфат. Следовательно, равновесие в реакции не может быть сдвинуто вправо в результате гидролиза пирофосфата. В самом деле, in vivo равновесие сдвинуто в сторону распада РНК, а не ее синтеза. Принципиальное отличие состоит в том, что полинуклеотид-фосфорилаза не использует матрицы. Состав РНК, синтезированной этим ферментом, определяется соотношением рибонуклеотидов в инкубационной смеси, а последовательность близка к случайной. Благодаря этому полинуклеотид-фосфорилаза оказалась ценнейшим инструментом в экспериментах по расшифровке генетического кода. Например, синтезировали, инкубируя в присутствии фермента раствор высокой

Рис. 26.3. Синтез белка в бесклеточной системе останавливается через несколько минут после добавления дезоксирибонуклеазы и возобновляется при добавлении мРНК.

концентрации UDP. Сополимеры двух ри-бонуклеотидов, например со случайной последовательностью готовили, также инкубируя UDP и АТР с этим ферментом.

Различные синтетические рибонуклео-тиды вводили в бесклеточную систему синтеза белка и измеряли включение меченного -фенилаланина. Результаты оказались поразительными:

Тот же эксперимент был проделан с различными С-аминокислотами в каждой инкубационной смеси. Оказалось, что вызывает синтез полилизина, синтез полипролина. Так было расшифровано три кодовых слова:

Кодовое слово невозможно было расшифровать таким же образом, потому что не работает в качестве матрицы. Возможно, это объясняется тем, что он образует трехцепочечную спиральную структуру. Полирибонуклеотиды, образующие протяженные участки с упорядоченной структурой, не эффективны в качестве матриц для синтеза белка.