30.3. При сборке вирусной частицы ВТМ белковые диски присоединяются к петле РНК

A priori простейший механизм сборки заключался бы в ступенчатом присоединении отдельных белковых субъединиц к РНК. Трудность, однако, состоит в этом случае в том, что скорость нуклеации будет чрезвычайно мала. Прежде чем комплекс замкнется сам на себя, образовав один оборот спирали, и таким образом стабилизируется, к гибкой молекуле РНК должно присоединиться примерно 17 субъединиц оболочки. Эта проблема может быть решена присоединением к РНК сразу целого комплекса из многих субъединиц. Действительно, белок оболочки легко образует двухслойный диск из 34 субъединиц. Каждый слой диска представляет собой кольцо из 17 субъединиц; примерно столько субъединиц (16 1/3) приходится на один оборот спирали ВТМ. Клуг и его сотрудники исследовали трехмерную структуру диска (рис. 30.5) и показали, что он представляет собой главный промежуточный продукт при сборке ВТМ. Важнейшее свойство диска состоит в том, что его субъединицы скользят относительно друг друга и образуют спираль их двух оборотов, так называемую «запорную шайбу» (рис. 30.6).

Диск гораздо быстрее взаимодействует с РНК ВТМ, чем с чужеродной ДНК. Следовательно, РНК ВТМ, по-видимому, содержит последовательность оснований, которую специфически узнает диск и которая

Рис. 30.4. Модель части ВТМ, на которой показана спиральная укладка белковых субъединиц вокруг одноцепочечной молекулы РНК. [Klug A., Caspar D. L. D., Advan. Virus Res., 7, 274 (1960).]

Рис. 30.5. (см. скан) Карта электронной плотности белкового диска ВТМ. Показан слой толщиной 6 А. (Печатается с любезного разрешения д-ра Aaron Klug.)

инициирует сборку. Эта область инициации была выделена следующим образом. К РНК ВТМ добавляли несколько дисков, чтобы покрыть область инициации, и затем расщепляли остальную РНК нуклеазой. Защищенный фрагмент содержит примерно 65 нуклеотидов, которые прочно и специфично связываются с дисками. Последовательность оснований в этой области инициации дает все основания думать, что этот фрагмент РНК образует структуру шпильки со стеблем, состоящим из спаренных оснований, и петлей (рис. 30.7). Самое интересное. что петля содержит в каждом третьем положении G. Такое расположение оснований в триплетах соответствует стехиометрии субьединиц оболочки вируса - одна субъединица на три нуклеотида. Следовательно, по всей вероятности, петля связывается с первым диском, и с этого начинается сборка вирусной частицы.

Неожиданно оказалось, что петля инициации расположена далеко от обоих концов РНК. Точка начала сборки расположена на расстоянии 5300 нуклеотидов от -конца и примерно 1000 нуклеотидов от 3-конца РНК. Другой неожиданностью было то, что оба конца РНК выходят с одной и той же стороны растущей частицы ВТМ (рис. 30.8). Длина 3-конца на протяжении процесса сборки остается более или менее постоянной

Рис. 30.6. Схема превращения белкового диска ВТМ в спиральную форму «запорной шайбы». [Klug A., Fed. Ргос., 31, 40 (1972).]

а -конец по мере удлинения вирусной частицы становится короче.

Наиболее вероятная модель образования частиц проиллюстрирована на рис. 30.9. Сборка начинается с проникновения петли инициации в центральное отверстие двухслойного белкового диска. Петля связывается с первым оборотом диска, и прилегающий стебель, состоящий из спаренных оснований, раскрывается. Это взаимодействие переводит диск в форму спиральной запорной шайбы, и диск захватывает РНК. Так начинается построение спирали вируса. Затем к новообразованной петле РНК, торчащей из центрального отверстия, присоединяется еще один диск. Благодаря протаскиванию -конца через центральное отверстие растущей вирусной частицы при добавлении каждого следующего диска образуется новая петля. Наконец, происходит одевание 3-конца каким-то пока непонятным способом.

Помимо того что двухслойный диск обеспечивает быструю нуклеацию, он существенно увеличивает специфичность образования оболочки. Диск может связываться со многими нуклеотидами, тогда как одна субъединица - только с тремя. Следовательно, диск обладает гораздо более высокой избирательностью по отношению к РНК ВТМ по сравнению с мРНК клетки-хозяина, чем одна субъединица. Еще одно важное свойство дисков состоит в том, что в физиологических условиях они не образуют спиралей без РНК. В этом отношении важнейшую роль играют две карбоксильные группы в каждой субъединице. При нейтральном значении рН в спиральной форме ионизированы обе карбоксильные группы, а в диске - только одна. Электростатическое отталкивание между близко расположенными карбоксилат-ионами в спиральной форме благоприятствует образованию диска. Связывание РНК со спиральной формой сопровождается достаточным изменением свободной энергии, чтобы преодолеть электростатическое отталкивание карбоксилатных ионов. Итак, карбоксилат-ионы - негативный регулятор, препятствующий образованию спирали без РНК.