37.6. При добавлении ацетилхолина реконструированные мембранные пузырьки становятся проницаемыми для катионов

В последние годы сделаны большие успехи в очистке ацетилхолиновых рецепторов и реконструировании функционально активных мембранных пузырьков. Наиболее подходящий исходный материал для таких исследований - электрический орган электрической рыбы, например Torpedo (электрический скат), который очень богат холинергическими постсинаптическими мембранами. Электрический орган образован из колонок клеток, называемых электрическими пластинками. Одна сторона клеток (ин-нервируемая поверхность) снабжена нервными окончаниями и электрически возбуди Другая сторона (неиннервируемая поверхность) образует многочисленные складки и электрически невозбудима.

Electrophorus electricus, американский электрический угорь.

Разность потенциалов, возникающая при стимуляции электрических пластинок, обусловлена асимметрией ответа двух поверхностей. У такой электрической рыбы, как Electrophorus, мембранный потенциал иннервируемой поверхности при возбуждении сдвигается с —90 до тогда как на неиннервируемой поверхности сохраняется Следовательно, в пик потенциала действия разность потенциалов между наружными

Рис. 37.9. Трехмерная структура нейротоксина, блокирующего рецептор ацетилхолина. Этот нейротоксин вырабатывается у морских змей. (Печатается с любезного разрешения д-ра Demetrius Tsernoglou и д-ра Gregory Petsko.)

поверхностями двух сторон составляет (рис. 37.8). Электрические пластинки электрического органа соединены параллельно, и, следовательно, их разность потенциалов складывается. Орган, состоящий из 5000 рядов электрических пластинок, может, таким образом, генерировать разряд в 750 В. Интересно отметить, что электрические пластинки электрического угря эволюционно возникли из мышечных клеток. При этом они сохранили электрически возбудимую наружную мембрану мышцы, но утратили аппарат сокращения. Электрический орган Electrophorus - великолепный источник -каналов.

Еще один экзотический биологический материал оказался бесценным источником ацетилхолиновых рецепторов. Для того, чтобы идентифицировать рецептор в смеси макромолекул, его необходимо специфически пометить. Для этого используют нейротоксины змей, в частности -бунгаротоксин из яда одной змеи с о. Тайвань и кобратоксин (из яда кобры). Указанные нейротоксины блокируют нейромышечное проведение, связываясь с рецепторами ацетилхолина на двигательных концевых пластинках или на иннервируемой поверхности электрических пластинок электрического органа. Нейротоксины представляют собой небольшие основные белки Их можно пометить радиоактивным изотопом с высокой удельной радиоактивностью. Для этого их либо иодируют иодом-125, либо превращают в шиффово основание с пиридоксальфосфатом с последующим восстановлением образованного продукта -боргидридом. Меченый кобратоксин прочно связывается с ацетилхолиновым рецептором (константа диссоциации - порядка и, что особенно важно, практически не связывается с другими макромолекулами постсинаптической мембраны. Таким образом, рецептор ацетилхолина можно специфически пометить радиоактивным атомом.

Путем обработки фрагментов мембраны неинным детергентом (таким, как производное полиоксиэтилена твин-80) удалось солюбилизировать рецепторы ацетилхолина электрического органа. Полученный раствор фракционировали методами гель-фильтрации и ионообменной хроматографии. Последним этапом очистки была аффинная хроматография на колонке, содержащей ковалентно связанный кобратоксин. В итоге был получен рецептор, очищенный в 10000 раз. Ацетилхолиновый рецептор представляет собой комплекс массой состоящий из четырех типов субъединиц. Субъединица метится по сродству радиоактивными соединениями, содержащими группу триметиламмония, что указывает на наличие в ней участка связывания ацетилхолина. Удалось получить мембранные пузырьки, содержащие очищенные рецепторы ацетилхолина; для этого к раствору рецепторов добавляли фосфолипиды и затем удаляли диализом детергент. Показано, что радиоактивные ионы натрия включенные в процессе реконструирования пузырьков в их внутреннее водное пространство, высвобождаются при добавлении ацетилхолина или его аналогов, например карбамоилхолина (рис. 37.10). Высвобождение ионов натрия блокируют бунгаротоксин и обычные антагонисты ацетилхолина; следовательно, оно опосредовано специфическим взаимодействием ацетилхолина со связанным с мембраной рецептором.