31.8. В лаборатории можно сконструировать новые геномы и клонировать их в клетках-хозяевах
Разработанная в последние годы технология рекомбинантных ДНК - важнейшее достижение молекулярной биологии. Появилась возможность создать в лабораторных условиях новые комбинации неродственных генов. Затем эти новые геномы можно ввести в подходящие клетки и размножить во много раз с помощью механизмов синтеза ДНК клетки-хозяина. Некоторые из таких введенных в клетки генов могут также транскрибироваться и транслироваться в новом окружении. Основные этапы клонирования ДНК сводятся к следующему (рис. 31.17).
1. Создание рекомбинантной молекулы. Интересующий исследователя фрагмент ДНК ковалентно присоединяется к ДНК вектора. Основное свойство вектора состоит в том, что он может автономно реплицироваться в подходящем хозяине. Например, плазмиды и фаг X наиболее удобные векторы для клонирования генов в клетках Е. coli. Как будет описано ниже, молекулы
Химерная ДНК - рекомбинантная молекула ДНК, содержащая неродственные гены. От слова химера - мифологическое существо с головой льва, телом козла и хвостом змеи. «...Коей порода была от богов, не от смертных: Лев головою, задом дракон и коза серединой, Страшно дыхала она пожирающим пламенем бурным». Гомер, «Илиада», пер. Н. Гнедича, гл. VI, стих 180.
ДНК можно соединить путем лигирования (т.е. воздействием лигазы) фрагментов с липкими одноцепочечными концами или же с тупыми концами.
2. Введение в клетку-хозяина. Большинство бактериальных и эукариотических клеток поглощает голые молекулы ДНК из среды. Эффективность поглощения низка (примерно 1 на 106 молекул ДНК), но в специально подобранных экспериментальных условиях можно трансформировать значительную часть клеток. Существует и другой метод: клетки заражают реконструированными вирионами, содержащими рекомбинантные молекулы ДНК. В таком синтетическом вирусном геноме интересующий исследователя ген замещает участок вирусной ДНК, не имеющий существенного значения для репликации.
Рис. 31.18. Электронная микрофотография 
плазмидного вектора, использованного для клонирования ДНК. (Печатается с любезного разрешения д-ра Stanley Cohen.)
3. Отбор. Следующий этап состоит в том, чтобы определить, какие клетки несут рекомбинантную молекулу ДНК, содержащую нужный ген. Такие клоны можно отобрать по признаку присутствия вектора или самого встроенного гена. Например, некоторые плазмидные векторы сообщают клетке устойчивость к какому-либо антибиотику. Другой подход состоит в том, чтобы определить, какие клетки связывают РНК, комплементарную нужному гену, или синтезируют кодируемый им белок. Клоны, содержащие рекомбинантную ДНК, стабильны, по крайней мере в течение нескольких сотен поколений.
Клонирование рекомбинантной ДНК уже внесло большой вклад в наши представления о структуре хромосомы и выражении гена. Многие встроенные гены удалось размножить путем клонирования, что дало большие количества ДНК для определения последовательности оснований и электронно-микроскопических исследований. Кроме того, с помощью этих клонов были синтезированы в больших количествах белки, которые в обычных условиях образуются в ничтожных количествах. Методы рекомбинантных ДНК используются также для изучения сложных геномов и регуляции их выражения.
