24.12. Открытие ДНК-полимеразы

Перейдем теперь к молекулярному механизму репликации ДНК. Артур Корнберг (Arthur Kornberg) и его коллеги в 1955 г. начали поиск фермента, синтезирующего ДНК. Вскоре этот поиск увенчался успехом, главным образом потому, что при планировании экспериментов были приняты три правильных решения, т.е. был сделан правильный выбор между несколькими возможностями.

1. Что представляют собой активированные предшественники ДНК? Корнберг и его коллеги сделали правильное предположение, что активированные промежуточные продукты синтеза ДНК - дезоксири-бонуклеозид-5-трифосфаты. В основе этого

Рис. 24.24. Фотографии гелей, на которых видна релаксация суперспирализованной ДНК вируса SV-40. Дорожка А - суперспирализованная ДНК с большим числом отрицательных витков. При инкубации ДНК с топоизомеразой в течение 5 мин (Б) и 30 мин (В) образуется ряд полос с более низкой степенью суперспирализации. [Keller W., Proc. Nat. Acad. Sci., 72, 2553 (1975).]

предположения лежали два соображения. Во-первых, пути биосинтеза пуринов и пиримидинов приводят к образованию нуклеозид-5-фосфатов (а не нуклеозид-3-фосфатов). Во-вторых, активированным промежуточным продуктом синтеза пирофосфатной связи в таких коферментах, как является АТР.

2. Что может служить критерием синтеза ДНК? Предполагалось, что абсолютное количество ДНК, синтезированной в первоначальных экспериментах, должно быть весьма невелико, главным образом из-за обилия нуклеаз. Поэтому нужен был какой-то чувствительный тест. Был разработан такой тест с использованием радиоактивных нуклеотидов-предшественников. Включение этих предшественников в ДНК обнаруживали путем измерения радиоактивности в осадке, полученном после обработки инкубационной смеси кислотой. В основе этого метода лежит тот факт, что ДНК осаждается кислотами, например трихлоруксусной кислотой, а нуклеотиды-предшественники остаются в растворе.

3. Какие клетки следует выбрать для исследования? После того как первоначальные эксперименты с экстрактами животных клеток дали отрицательные результаты, выбор пал на бактерии Е. coli, поскольку деление этих клеток происходит всего лишь за 20 мин (время генерации), и, следовательно, их можно выращивать в больших количествах. Как и предполагалось, эта бактерия исключительно богата ферментами, участвующими в синтезе ДНК.

Экстракт Е. coli инкубировали с радиоактивным дезокситимидин-5-трифосфатом. Радиоактивность этого -меченного предшественника составляла мин. Радиоактивность осадка, полученного добавлением к инкубационной смеси кислоты, составляла всего Было синтезировано лишь несколько пикомолей ДНК, но этим было положено начало. Корнберг писал: «Хотя количество нуклеотида, включившегося в состав нуклеиновой кислоты, было ничтожным, оно было существенно выше уровня фона. Мы попробовали забить клин в эту узенькую щелку.

Рис. 24.25. Электронная микрофотография молекул ДНК-полимеразы (сферические структуры), связанных с молекулой ДНК (тонкая нить). (Печатается с любезного разрешения д-ра Jack Griffith.)

Рис. 24.26. Реакция элонгации цепи, катализируемая ДНК-полимеразой.

Молотком нам служила очистка фермента - метод, отработанный при изучении спиртового брожения».

Этот новый фермент был назван ДНК-полимеразой (рис. 24.25). Теперь его называют ДНК-полимеразои I, так как с тех пор были выделены другие ДНК-полимеразы. После десяти лет напряженной работы в лаборатории Корнберга ДНК-полимераза I была очищена до гомогенного состояния и детально охарактеризована. Насколько велики были масштабы проделанной работы, говорит тот факт, что для получения чистого фермента необходимо было взять клеток E.coli.

ДНК-полимераза I - это единая полипептидная цепь с массой Она катализирует последовательное присоединение дезоксирибонуклеиновых звеньев к цепи ДНК:

Для синтеза цепи ДНК ДНК-полимеразе I необходимы следующие компоненты:

1. В среде должны присутствовать все четыре дезоксирибонуклеозид-5-трифосфата: dATP, dGTP, dTTP и dCTP. В дальнейшем мы будем обозначать эти дезоксирибонуклеозидтрифосфаты общим символом dNTP. Кроме того, необходимы ионы

2. ДНК-полимераза I присоединяет дезоксирибонуклеотиды к 3-гидроксильному концу предсуществующей цепи ДНК (или РНК). Другими словами, необходима затравочная цепь, или затравка, со свободной 3-гидроксильной группой.

3. Необходима матричная ДНК. Матрицей может служить как одно - так и двухцепочечная ДНК. Двухцепочечная ДНК служит эффективной матрицей лишь в том случае, если ее сахарофосфатный остов разорван в одном или нескольких местах.

Реакция элонгации (удлинения) цепи, катализируемая ДНК-полимеразой, происходит путем нуклеофильной атаки 3-ОН-концом матрицы ближайшего к рибозе атома фосфора очередного дезоксирибонуклеозидтрифосфата. В результате образуется фосфодиэфирный мостик и одновременно высвобождается пирофосфат (рис. 24.26). Последующий гидролиз пирофосфата обеспечивает дальнейшую полимеризацию. Такое смещение общего состояния равновесия было бы невозможно, если бы активированными промежуточными продуктами служили нуклеозиддифосфаты. Именно в этом мы усматриваем убедительную причину преобладания нуклеозидтрифосфатов по сравнению с дифосфатами в качестве активированных предшественников в биосинтетических реакциях. Элонгация цепи ДНК происходит в направлении (рис. 24.27). За секунду одна молекула ДНК-полимеразы I присоединяет примерно 10 нуклеотидов. Полимеризация

Рис. 24.27. ДНК-полимеразы катализируют рост цепей ДНК в направлении

процессивна, т. е. фермент присоединяет много нуклеотидов, оставаясь связанным с одной матрицей.