31.14. Перспективы клонирования генов

Метод рекомбинантных ДНК открыл новые горизонты в молекулярной биологии. Увеличение числа генов путем клонирования в бактериях дает неограниченные количества ДНК для электронно-микроскопического анализа и определения последовательности нуклеотидов. Исследуются специфические участки ДНК, отвечающие за подвижность генов, репликацию ДНК и транскрипцию. Возникают совершенно новые направления; примером может служить открытие вставочных последовательностей во многих эукариотических генах.

Рис. 31.26. (см. скан) Синтез предшественника инсулина - проинсулина в трансформированных клетках Е. coli.

Появилась возможность быстро картировать сложные хромосомы и разделять их на отдельные элементы, которые поддаются различным манипуляциям. Темпы исследований постоянно нарастают. Кроме того, клонирование генов становится важным способом получения определенных белков в больших количествах. Например, с помощью рекомбинантных молекул можно увеличить в 500 раз количество ДНК-лигазы, образующейся в клетках Е. coli. Наиболее многообещающим представляется синтез пептидов и белков эукариот трансформированными бактериями. В недалеком будущем такие гормоны, как инсулин, и такие противовирусные агенты, как интерферон, будут продуцироваться бактериями. В фармакологии начинается новая эра, которая, по-видимому, окажет глубокое воздействие на медицину. Исследуются также возможности клонирования генов для увеличения сельскохозяйственного производства. Эукариотические гены вводят в настоящее время не только в бактерии, но и в эукариотические клетки. Например, вирус SV-40 был использован в качестве вектора для переноса гена глобина кролика в клетки почек обезьяны. Такие зараженные клетки синтезировали значительные количества в-глобина кролика. Этот экспериментальный подход является многообещающим методом расшифровки регуляторных механизмов экспрессии эукариотических генов.

Заключение

При генетической рекомбинации новая молекула ДНК образуется путем разрыва и воссоединения цепей ДНК. Взаимообмен может произойти между любой парой гомологичных последовательностей родительских молекул ДНК, и потому этот процес называется общей генетической рекомбинацией. У Е. coli общая рекомбинация

Рис. 31.27. Синтез пептидного гормона соматостатина клетками Е. соli, трансформированными химически синтезированным геном.

осуществляется под действием генов rec. Белок recВС - нуклеаза; она образует одноцепочечную ДНК, которая может внедряться в двухцепочечную молекулу ДНК. Эта реакция связывания одноцепочечной молекулы катализируется белком recA, который одновременно гидролизует АТР.

В генетических перестройках негомологичных локусов участвуют подвижные генетические элементы, называемые транспозонами (элементы, способные к переносу -транспозиции). Плазмиды (небольшие кольцевые двухцепочечные ДНК) - важный класс подвижных генетических элементов. Эти дополнительные хромосомы несут гены, отвечающие за инактивацию антибиотиков, метаболизм природных соединений и образование токсинов. Плазмиды могут реплицироваться автономно или интегрировать с хромосомой клетки-хозяина. Фактор F (фактор плодовитости) - плазмида, сообщающая бактериям способность передавать гены другим бактериям путем коньюгации. Для коньюгации необходим непосредственный физический контакт между донорной и реципиентной клетками. Плазмиды факторы R обеспечивают устойчивость к антибиотикам. Более крупные из этих плазмид содержат фактор переноса устойчивости (RTF), обусловливающий переход плазмиды в другую бактерию при коньюгации. Некоторые гены, обеспечивающие устойчивость к антибиотикам, могут быть сцеплены с областью RTF. Поэтому множественная устойчивость к лекарственным средствам может быть трансмиссивной. Транспозоны обладают высокой подвижностью, так как они обрамлены -элементами. Эти концевые последовательности направляют действие белков, участвующих в их интеграции с ДНК. Транспозон не обязательно гомологичен реципиентной ДНК.

В лаборатории можно создать новые сочетания неродственных генов и клонировать их в клетках-хозяевах. Прежде всего синтезируется рекомбинантная молекула ДНК путем соединения какого-либо фрагмента ДНК с ДНК вектора, который может автономно реплицироваться в подходящем хозяине. Наиболее подходящие векторы - фаг лямбда, вирус SV-40 и плазмиды. Ферменты рестрикции и ДНК-лигаза - основные инструменты для получения новых молекул ДНК. Липкие концы, гомополимерные концевые фрагменты и химически синтезированные линкеры - три способа соединения

молекул ДНК. Рекомбинантные молекулы ДНК можно ввести в клетки-хозяева, заражая их реконструированным вирусом или инкубируя их в присутствии голых молекул ДНК. Последний этап заключается в отборе клеток, несущих нужную молекулу рекомбинантной ДНК, с использованием какого-либо отличительного свойства введенного гена (например, устойчивости к антибиотику). Имея рестриктазный гидролизат геномной ДНК, можно клонировать в клетках Е. coli определенные эукариотические гены. Многие эукариотические гены могут транскрибироваться и транслироваться в бактериальных клетках. Клонирование генов — мощный метод исследования организации и выражения сложных генов. Кроме того, технология рекомбинантных ДНК - весьма многообещающий метод для синтеза больших количеств генов и белков, имеющихся в обычных клетках в ничтожных количествах.

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

(см. скан)

Часть V. Молекулярная физиология

Взаимосвязь между информацией, конформацией и метаболизмом в физиологических условиях

Микрофотография палочек сетчатки, полученная с помощью сканирующего микроскопа. Для возбуждения палочки достаточно одного фотона. (Печатается с любезного разрешения д-ра Deric Bownds.)