7.3. Поиски активного центра лизоцима

Детальное воспроизведение трехмерной структуры лизоцима еще не раскрывало механизма его каталитического действия. Более того, рассматривая карту электронной плотности, трудно было определить хотя бы локализацию активного центра. В отличие от миоглобина и гемоглобина в лизоциме нет простетической группы, т. е. нет встроенного маркера активного центра. В итоге основную информацию, необходимую для идентификации активного центра, определения способа связывания субстрата и выяснения механизма ферментативного действия, удалось получить только при использовании ингибиторов, а именно при рентгеноструктурном анализе комплексов лизоцима с ингибиторами. Если трехмерная структура белка известна, то определить методом рентген оструктурн ого анализа способ связывания с ним небольших молекул обычно уже нетрудно. Эти опыты легко выполнимы, потому что кристаллы белка очень пористы. Даже относительно большие молекулы ингибитора способны диффундировать по каналам между молекулами белка, попадая в участки специфического связывания. Изменение электронной плотности, обусловленное встраиванием дополнительной молекулы, можно рассчитать непосредственно по интенсивности рефлексов

Рис. 7.5. Последовательность аминокислот в лизоциме из белка куриных яиц. Красным показаны остатки, входящие в состав активного центра. [Canfield R. Е., Liu А. К., J.Biol. Chem., 240, 2000 (1965); Phillips D.C, Sci. Amer., (5) 215, 79 (1966).]

(используя данные, полученные предварительно на нативном белке) при условии, что структура кристалла не претерпела существенных изменений. Такой подход получил название разностного метода Фурье.

Рис. 7.6. Рентгенограмма кристалла лизоцима. (Печатается с любезного разрешения д-ра D. Phillips.)

В идеале следовало бы использовать разностный метод Фурье для определения структуры фермент-субстратного (ES) комплекса в процессе катализа. Однако в обычных условиях превращение связанного субстрата в продукт реакции происходит значительно быстрее, чем диффузия новых молекул субстрата в кристалл. В некоторых случаях это осложнение удается устранить

Рис. 7.7. Трехмерная структура лизоцима. Показаны только -угле-родные атомы. (Печатается с любезного разрешения д-ра D. Phillips.)

Рис. 7.8. Формула три--ацетилглюко-замина (три-NAG, или конкурентного ингибитора лизоцима.

замедлением каталитического процесса, что достигается путем сильного охлаждения кристалла (например, до — Этот экспериментальный подход получил название криоэнзимологии. Существует и другой подход: исследуют комплекс фермента с таким аналогом субстрата, который либо совсем не подвергается никаким превращениям, либо эти превращения происходят очень медленно. Для лизоцима таким аналогом субстрата оказался тример N-ацетилглюкоза-мина (три - или структура которого показана на рис. 7.8. Олигомеры N-ацетилглюкозамина, содержащие менее 5 остатков, гидролизуются крайне медленно или не гидролизуются совсем. Тем не менее они связываются с активным центром фермента. Именно поэтому три-NAG является мощным конкурентным ингибитором лизоцима.