10.9. Отдельные белки мембран глубоко погружены в липидный бислой
Некоторые мембранные белки удается выделить методами мягкой обработки, например экстрагированием раствором высокой ионной силы (например, 
Другие белки оказываются более прочно связанными с мембраной - их можно отделить лишь с помощью детергента (рис. 10.17) или органического растворителя. Исходя из различий в прочности связи с мембраной, соответствующие белки подразделяют на периферические и интегральные (рис. 10.18). Интегральные белки образуют многочисленные связи с углеводородными цепями мембранных липидов, и потому их можно выделить только с помощью агентов, конкурентно участвующих в этих неполярных взаимодействиях. Периферические белки, напротив, связаны с мембранами электростатическими силами и водородными связями. Эти полярные взаимодействия могут быть разрушены при добавлении солей или изменении рН. Согласно последним данным, периферические белки мембран в большинстве случаев присоединяются к поверхности интегральных белков.
Для того чтобы определить, локализован ли данный белок во внутренней части мембраны, используют главным образом электронно-микроскопический метод замораживания—скалывания. Клетки или фрагменты мембраны быстро замораживают до температуры жидкого азота. Замороженную мембрану раскалывают далее толчком ножа микротома. Скол обычно проходит продольно посередине бислоя (рис. 10.19). В результате раскрывается значительная область внутренней части липидного бислоя. Далее эту
Рис. 10.18. Интегральные белки (а, б, в) мембраны образуют большое число связей с углеводородными цепями бислоя. Периферические мембранные белки (г) присоединяются к поверхности интегральных белков.
Рис. 10.19. Электронно-микроскопический метод замораживания-скалывания. Плоскость скола проходит посередине мембраны бислоя. [Singer S. J., Hosp. Pract., 8, 81 (1973).]
обнажившуюся поверхность покрывают путем напыления слоем угля или платины, что дает реплику внутренней части бислоя. Для изучения наружной поверхности мембраны метод замораживания-скалывания используют в сочетании с методом глубокого травления. При этом сначала путем скола обнажают внутреннюю часть замороженной мембраны. Далее высушивают лед на прилежащей поверхности мембраны-это метод глубокого травления. Сочетание двух методов, называемое электронной микроскопией с применением замораживания—травления, позволяет получить картину внутренней части мембраны и обеих ее поверхностей. Достоинство рассматриваемого подхода состоит в том, что он не требует фиксации и обезвоживания биологического материала.
В исследованиях методом замораживания-травления было непосредственно доказано присутствие интегральных белков во многих биологических мембранах. Например, в мембране эритроцита содержатся глобулярные частицы высокой плотности диаметром около 75 А (рис. 10.20). Большое число глобулярных частиц имеется также внутри мембраны саркоплазматического ретикулума. В отличие от этого искусственный бислой из фосфатидилхолина имеет совершенно гладкую поверхность скола. Оказались большей частью гладкими и поверхности скола миелиновой мембраны, что и следовало ожидать от этой относительно инертной мембраны, функционирующей главным образом в качестве изолирующей поверхности.
