3.3. Этапы рентгеноструктурного анализа миоглобина
Кендрью выбрал миоглобин для проведения рентгеноструктурного анализа в силу многих причин: это относительно небольшой белок (17,8 к Да), его легко получить в больших количествах, и он легко кристаллизуется. Кроме того, миоглобин имеет и то достоинство, что он очень сходен с гемоглобином, исследованием которого уже занимался коллега Кендрью Перутц. В работе был использован миоглобин из скелетных мышц кашалота, отличающийся стабильностью и способностью великолепно кристаллизоваться. Скелетные мышцы ныряющих млекопитающих - китов, тюленей, дельфинов - особенно богаты миоглобином, который служит для резервирования кислорода, используемого во время ныряния.
Кристалл миоглобина помещают в капилляр и строго ориентируют по
Рис. 3.4. Кристаллизация миоглобина.
отношению к пучку рентгеновских лучей и к пленке. В результате прецессионного движения кристалла на рентгеновском фотоснимке образуется регулярная решетка пятен (рефлексов). Рентгеновская фотография, показанная на рис. 3.7, представляет собой двумерное сечение через трехмерное множество рефлексов. Кристалл миоглобина дает 25 000 рефлексов. Измеряют интенсивность каждого рефлекса. Получаемые величины представляют собой те исходные экспериментальные данные рентгеноструктурного анализа, которыми оперируют далее.
На следующем этапе воспроизводят структуру миоглобина, исходя из полученных значений интенсивности рефлексов: это производится с помощью математического метода представления сложных функций в виде гармонических рядов Фурье. Однако величины интенсивности рефлексов от кристаллов миоглобина дают только часть информации, необходимой для таких расчетов. Недостающие данные о фазах рассеянных пучков лучей получают из полной картины дифракции лучей кристаллом миоглобина, содержащего хяжелые атомы, например уран или свинец, по одну или две стороны молекулы. После этого переходят к расчету карты электронных плотностей, используя быстродействующие ЭВМ. По счастью, развитие кристаллографических исследований миоглобина совпало по времени с появлением быстродействующих ЭВМ с большим объемом памяти.
Рис. 3.5. Фотография кристаллов миоглобина. (Печатается с любезного разрешения д-ра J. Кеndrew.)
Рис. 3.6. Схема установки для проведения рентгеноструктурного анализа: рентгеновский луч, кристалл, детектор.
Окончательный расчет по методу рядов Фурье для миоглобина включал в себя около миллиарда величин.
В результате проведенной математической обработки получают величины электронной плотности в большом числе регулярно расположенных в пространстве точек кристалла. При этом трехмерное распределение электронных плотностей имеет вид серии наслоенных один над другим параллельных срезов. Каждый срез представляет собой прозрачную пластинку из синтетического материала, на которой распределение электронных плотностей показано контурными линиями (рис. 3.8). Такое изображение можно сравнить с картой рельефа земной поверхности, на которой контурными линиями обозначается высота местности над уровнем моря (рис. 3.9).
Следующий этап работы состоит в расшифровке карты электронных плотностей. Критическим фактором при этом выступает разрешающая способность метода рентгеноструктурного анализа, которая определяется количеством рефлексов, использованных в обратном преобразовании Фурье. Правильность изображения зависит от разрешающей способности обратного преобразования Фурье, как это показано с помощью оптической аналогии на рис. 3.10. Анализ миоглобина был выполнен в три этапа. На первом этапе, завершенном в 1957 г.,
Рис. 3.7. Рентгенограмма кристалла миоглобина.
Рис. 3.8. Часть карты электронной плотности миоглобина: участок гема. Пик в центре соответствует положению атома железа. (Kendrew J. С., The thredimensional structure of a protein molecule, Scientific American, Inc., 1961.)
анализу были подвергнуты только 400 внутренних рефлексов на дифракционной картине, что соответствовало разрешению 6 А. Как будет показано несколько ниже, такая карта электронных плотностей низкого разрешения описывает полипептидную цепь, но выявляет мало других деталей структуры. Дело в том, что из-за особенностей укладки полипептидных цепей их центры расходятся на 5-10 А. Чтобы выявить расположение групп атомов, отстоящих на 
друг от друга, или отдельных атомов, разделенных расстоянием в 
требуются карты более высокого разрешения. В 1959 г. была получена карта миоглобина с разрешением 
рефлексов), а в 1962 г. с разрешением 1,4 А (25000 рефлексов). Предел разрешающей способности рентгено-структурного анализа определяется степенью совершенства структуры кристалла. Для белков этот предел обычно не ниже 2 А.
В 1957 г. Кендрью и его сотрудники увидели то, чего до них никто не видел: пространственную структуру белковой молекулы во всей ее сложности. Модель, построенная на основании обратного преобразования Фурье с разрешением 6 А, состояла из набора отрезков высокой плотности, имеющих именно те размеры, какие и приписывались полипептидной цепи (рис. 3.11). Молекула имела очень компактный вид. Более подробное изучение показало, что она состоит из сложной и переплетающейся сети этих отрезков, которые
Рис. 3.9. Часть физической карты США; показан участок Капитолпика, штат Колорадо.
Рис. 3.10. (см. скан) Влияние разрешающей способности на качество реконструированного изображения. Для иллюстрации использован оптический аналог дифракции рентгеновских лучей. А-Парфенон, Б-картина дифракции от Парфенона, 
-изображения, полученные по данным, взятым из рис. Б. Для получения изображения, показанного на рис. Г, использовано больше точек, чем для получения изображения на рис. В. Соответственно изображение 
значительно выше качеством. [Печатается с любезного разрешения 
то шли прямо на некотором протяжении, то делали угол, меняя направление. Расположение атома железа в геме было легко установить, так как железо содержит значительно больше электронов, чем любой другой атом в белке. Самое поразительное в структуре молекулы - это ее неправильность и полное отсутствие симметрии.
