8.6. Участие гистидина-57 в катализе выявляется с помощью аффинной метки

Участие в катализе второго аминокислотного остатка было установлено путем использования так называемой аффинной метки, или метки по сродству. Метод заключается в том, что к химотрипсину добавляют вещество, которое 1) специфически связывается в активном центре в силу подобия с субстратом и затем 2) образует стабильную ковалентную связь с некоторой группой, расположенной на ферменте поблизости. Таким веществом является тозил--фенилала-нинхлорметилкетон (ТФХК), строение которого показано на рис. 8.12. Наличие боковой цепи фенилаланина в ТФХК обеспечивает его специфическое связывание с химотрипсином. Реактивная группа ТФХК - это хлорметилкетон. ТФХК атакует химотрипсин только по гистидину-57, алкилируя один из атомов азота гистидинового кольца (рис. 8.13). ТФХК - производное химотрипсина лишено ферментативной активности. Имеется три довода в пользу присутствия гистидина-57 в активном центре фермента. Во-первых, аффинная метка в высокой степени стереоспецифична: D-изомер ТФХК абсолютно неэффективен. Во-вторых, присутствие конкурентного ингибитора трипсина - р-фенил-пропионата - тормозит реакцию с ТФХК.

Рис. 8.12.

Структура тозил--фенилала-нинхлорметилкетона (ТФХК), используемого в качестве аффинной метки химотрипсина -тозильная группа).

В-третьих, скорость инактивации химотрипсина при добавлении ТФХК находится примерно в такой же зависимости от рН, как скорость катализа.