5.4. Получение пептидных карт: выявление аминокислотной замены в гемоглобине серповидных клеток

Итак, электрофоретический анализ показал, что гемоглобин S имеет 2-4 дополнительных положительных заряда по сравнению с гемоглобином А. Возможны разные пути возникновения такого различия в заряде молекулы:

(см. скан)

Выяснение вопроса, какая конкретно замена произошла в гемоглобине S, относится к 1954 г., когда Верной Ингрем (V. Ingrem) разработал новый метод определения аминокислотных замен в белках. Для проведения анализа молекулу гемоглобина расщепляли на фрагменты, поскольку в небольших пептидах, содержащих примерно по 20 аминокислот, выявить замену аминокислоты, безусловно, легче, чем в целой молекуле белка, значительно большей (в 10 раз) по размеру. Гемоглобин подвергали специфическому расщеплению трипсином по пептидным связям, образованным карбоксильными группами лизина и аргинина.

Рис. 5.5. Электрофорез на крахмальном геле при рН 8,6 гемоглобина здорового человека, гемоглобина носителя признака серповидноклеточности и гемоглобина больного серповидноклеточной анемией.

Рис. 5.6. Смесь пептидов разделяют путем электрофореза в горизонтальном направлении с последующей хроматографией в вертикальном направлении.

Поскольку в ab-половине гемоглобина содержится в общей сложности 27 остатков лизина и аргина, при триптическом гидролизе образовалось 28 разных пептидов. Следующий этап состоял в разделении полученных пептидов. Для этого был применен метод двумерного разделения (рис. 5.6). Смесь пептидов наносили в виде небольшого пятна в угол большого листа фильтровальной бумаги. Далее проводили электрофорез в одном направлении, разделяя таким образом пептиды в соответствии с их общим зарядом. Однако полного разделения смеси при этом не происходило. Многие пептиды накладывались друг на друга. Поэтому продолжали процесс разделения, но уже методом хроматографии на бумаге, причем это разделение проводили в направлении, перпендикулярном направлению электрофореза.

Хроматография - термин введен Михаилом Цветом в 1906 г. применительно к разделению смеси пигментов из листьев растения на колонке карбоната кальция. М. Цвет сравнил этот процесс с «разложением света на спектр».

Образовано от греческих слов chroma - цвет и graphein - рисовать, писать.

Процедура состояла в следующем: конец бумаги, ближайший к разделяемым пептидам, помещали в смесь органических растворителей и воды, налитую на дно герметично закрывающейся стеклянной банки. При этом растворитель поднимался вверх по бумаге. В такой ситуации каждый пептид мог либо мигрировать с растворителем (неполярная среда), либо оставаться на обводненной целлюлозе бумаги (высокополярная среда). Такой метод разделения называется распределительной хроматографией. Пептид с наиболее выраженными неполярными свойствами будет растворяться в растворителе и, следовательно, подниматься вместе с фронтом растворителя вверх по бумаге; в то же время самый полярный из пептидов останется на бумаге внизу. Рассматриваемые методы - хроматография на бумаге и электрофорез - дополняют друг друга, поскольку они разделяют пептиды на основе независимых свойств; первый - на основе различий в полярности, второй - на основе различий в общем заряде. Вся последовательность проведения анализа - избирательное расщепление белка на небольшие пептиды с их последующим разделением в двух направлениях - называется методом пептидных карт (отпечатков пальцев).

Получаемые в результате пептидные карты дают очень наглядный результат. После окрашивания нингидрином пятна пептидов становятся ясно видны. Сравнение карт гемоглобина А и гемоглобина показало, что все их пептидные пятна идентичны, за исключением одного. Это пятно элюировали с каждой из пептидной карт и определили, что в обоих случаях оно соответствует пептиду из 8 аминокислот. При последующем аминокислотном анализе обнаружилось, что пептид гемоглобина отличается от пептида гемоглобина А лишь по одной аминокислоте.