8.4. При катализе химотрипсином часть субстрата ковалентно связывается с ферментом

Химотрипсин катализирует гидролиз пептидных и эфирных связей в два отдельных

Рис. 8.5. Трехмерная структура -химотрипсина. Показаны только -углеродные атомы. Цветом отмечены участвующие в катализе остатки. (Blow D. М. In: The Enzymes, P.D. Boyer, ed., 3rd ed., v. 3, Acad. Press, 1971, p. 194)

этапа. Впервые это было обнаружено при изучении кинетики гидролиза -нитрифенилацетата. При использовании больших количеств фермента можно отчетливо проследить наличие двух фаз в высвобождении одного из продуктов реакции-п-нитрофенола (рис. 8.8). Сначала наблюдается быстрое взрывообразное высвобождение -нитрофенола, после чего он образуется уже с меньшей стационарной скоростью.

На первом этапе -нитрофенилацетат присоединяется к химотрипсину, т.е. образуется фермент-субстратный комплекс (рис. 8.9). Эфирная связь в субстрате при этом расщепляется. Один из продуктов реакции - -нитрофенол - высвобождается, тогда как ацетильная группа субстрата становится ковалентно связанной с ферментом. Далее вода атакует ацетил-ферментный комплекс с образованием ацетат-иона и регенерированного фермента (рис. 8.10). Начальная быстрая фаза высвобождения -нитрофенола соответствует этапу образования ацетил-ферментного комплекса. Этот этап называется ацилированием. Более медленное стационарное образование -нитрофенола соответствует этапу гидролиза ацетил-ферментного комплекса и регенерации свободного фермента. Этот второй этап, называемый деацилированием, лимитирует скорость всего процесса гидролиза эфиров химотрипсином. Более того, ацетил-ферментный комплекс настолько стабилен, что при благоприятных условиях его удается выделить. Механизм катализа

Рис. 8.6. Химотрипсин катализирует гидролиз пептидных и эфирных связей.

ном можно представить в виде следующей схемы:

где аминный (или спиртовой) компонент субстрата, промежуточный продукт, образованный в результате ковалентного связывания, -кислотный компонент субстрата.

Особенность этого механизма реакции состоит в образовании промежуточного продукта путем ковалентного связывания; в рассмотренном выше случае происходило ковалентное соединение ацетильной группы с ферментом. В общем случае группа, присоединенная к химотрипсину на стадии всегда ацильная группа. Таким образом, представляет собой промежуточное соединение ацил-фермент.