10.13. Липиды и многие мембранные белки быстро диффундируют в плоскости мембраны

Биологические мембраны - это не застывшие структуры. Напротив, и липиды, и многие белки мембран постоянно перемещаются в латеральном направлении. Быстрое движение белков мембраны выявляется с помощью флуоресцентной микроскопии при следующей постановке опыта. Культивируемые клетки человека и клетки мыши можно заставить слиться друг с другом; образующаяся при этом гибридная клетка называется гетерокарион. Одна часть плазматической мембраны гетерокариона происходит из клетки мыши, а другая - из клетки человека. Остаются ли мембранные белки мыши и человека разделенными в

Рис. 10.24. Последовательность аминокислот и трансмембранная локализация гликофорина А из эритроцитов. 15 углеводных единиц, присоединенных к остаткам серина и треонина, показаны светло-зеленым, а одна углеводная единица, присоединенная к боковой цепи аспарагина, - темно-зеленым. Гидрофобные аминокислотные остатки, погруженные в бислой, выделены желтым. С-концевая часть молекулы белка, расположенная внутри клетки, несет много отрицательно заряженных (красные) и положительно заряженных (синие) аминокислотных остатков. В числе углеводных единиц в N-концевой части белковой молекулы, лежащей вне клетки, много отрицательно заряженных групп сиаловой кислоты. (Печатается с любезного разрешения д-ра V. Marchesi.)

гетерокарионе или они смешиваются? Для ответа на этот вопрос использовали маркеры, а именно антитела с флуоресцентной меткой и далее визуально наблюдали за ними с помощью светового микроскопа. Антитело к мембранным белкам мыши имело зеленую флуоресценцию, а антитело к мембранным белкам человека - красную (рис. 10.26). В новообразованном гетерокарионе одна половина поверхности светилась зеленым, а другая - красным. Однако меньше чем через час (при 37 °С) участки зеленой и красной флуоресценции полностью смешивались. Этот опыт показывает, что мембранный белок способен диффундировать на

Рис. 10.25. Углеводные остатки гликолипидов и гликопротеинов как правило, локализованы на наружной поверхности плазматических мембран клеток млекопитающих.

(см. скан)

расстояние порядка нескольких микрон примерно за 1 мин.

Более общий и количественный метод измерения латеральной диффузии мембранных компонентов в интактных клетках состоит в определении скорости восстановления флуоресценции после тушения (рис. 10.27). Для этого определенный компонент на поверхности клетки специфически метят флуоресцентным хромофором и помещают небольшую часть поверхности клетки в поле зрения флуоресцентного микроскопа. Далее, находящиеся в поле зрения флуоресцирующие молекулы разрушают мощным пучком лазерных лучей. После этого определяют время нового появления флуоресценции в поле зрения, используя только слабое освещение, чтобы избежать дополнительного тушения. Если меченый компонент подвижен, то обесцвеченные молекулы исчезнут из поля зрения, а их место займут флуоресцирующие молекулы; в итоге интенсивность флуоресценции в поле зрения возрастет. Скорость восстановления исходного уровня флуоресценции зависит от латеральной подвижности флуоресцентно-меченого компонента, которую можно выразить через коэффициент диффузии Среднее расстояние пройденное по плоскости за время зависит от в соответствии с уравнением

Коэффициент диффузии липидов в различных мембранах составляет примерно . Таким образом, молекула фосфолипида диффундирует в среднем на расстояние см, или за 1 с. Это означает, что молекула липида может переместиться с одного конца бактериальной клетки на другой за 1 с. Экспериментально установленная величина коэффициента диффузии показывает, что вязкость мембран примерно в 100 раз выше вязкости воды и близка к вязкости оливкового масла.

В отличие от липидов белки очень неоднородны в отношении латеральной подвижности. Некоторые белки почти так же подвижны, как липиды, другие - практически неподвижны. Так, фоторецепторный белок родопсин характеризуется очень высокой подвижностью: его коэффициент диффузии равен С другой стороны, фибронектин (периферический гликопротеин, участвующий во взаимодействии клетки с субстратом) имеет коэффициент диффузии D менее см Малая подвижность некоторых белков, возможно, объясняется тем, что они закреплены на субмембранных цитоплазматических структурах.

Рис. 10.26. Схематическое изображение слияния клетки мыши и клетки человека с последующей диффузией мембранных компонентов в плоскости мембраны. Спустя несколько часов после слияния маркеры с зеленой и красной флуоресценцией полностью перемешиваются.

Рис. 10.27. Метод восстановления флуоресценции после фототушения. А - флуоресценция меченого компонента клеточной поверхности на небольшом освещенном участке клетки. -флуоресцирующие молекулы обесцвечивают интенсивной световой вспышкой. В - по мере того как в результате диффузии обесцвеченные молекулы выходят из освещенной области, а не подвергшиеся обесцвечиванию входят в нее, происходит восстановление флуоресценции до исходного уровня. -скорость восстановления зависит от коэффициента диффузии.