7.5. От структуры фермента — к механизму ферментативного действия

1. Как происходит связывание субстрата? Мы уже говорили о том, что метод рентгеноструктурного анализа не дает возможности непосредственно определить, как происходит связывание с ферментом эффективного субстрата. Однако данные, полученные при рентгеноструктурном анализе комплекса фермент — конкурентный ингибитор, могут сыграть ключевую роль в решении этой

Рис. 7.9.

Водородные связи между три-NAG и лизоцимом. Участвующие в образовании водородных связей химические группы субстрата показаны синим, соответствующие группы фермента - красным.

проблемы. Три-NAG заполняет только половину щели в молекуле лизоцима. Это очень многообещающее исходное положение. Было сделано допущение, что наблюдаемое связывание три-NAG как ингибитора происходит с образованием тех же связей, которые возникают и при связывании субстрата. Вполне вероятно, что для образования реакционноспособного -комплекса требуются дополнительные остатки сахара, способные заполнить вторую половину щели. Действительно, после присоединения три-NAG в щели остается место еще для трех остатков сахара. Это обнадеживало, поскольку было известно, что гексамер N-ацетилглюкозамина быстро гидролизуется ферментом.

При тщательном построении моделей в щели на ферменте поместились три дополнительных остатка сахара, обозначенных (рис. 7.10). Остатки подошли прекрасно, образуя несколько прочных водородных связей и контактов, обусловленных вандерваальсовыми взаимодействиями. Однако остаток D входил в щель только при условии некоторой деформации. При нормальной конформации (в виде кресла) его атомы оказывались слишком сближенными с некоторыми группами на ферменте.

2. Какая из связей расщепляется ферментом? Скорость гидролиза олигомеров N-ацетилглюкозамина стремительно возрастает при увеличении числа остатков сахара от 4 до 5, т.е. от до (табл. 7.1). Удлинение субстрата еще на один остаток дает дополнительное увеличение скорости расщепления; однако возрастание числа остатков сахара в субстрате до 8 уже не оказывает действия. Эти данные согласуются с результатами рентгеноструктурного исследования, показавшими, что именно шести остатков сахара достаточно для заполнения щели, где расположен активный центр.

Какая из связей в расщепляется ферментом? Исходя из того, что три-NAG не подвергается расщеплению, можно считать, что связь (т.е. гликозидная связь между остатками - это не та связь, на которую действует фермент. Аналогично этому фермент не может расщеплять и связи Второе и решающее доказательство того, что связь не

Рис. 7.10. Способ связывания гекса-NAG (показан желтым) с лизоцимом. Расположение углеводных остатков (слева) соответствует локализации три-NAG в комплексе с лизоцимом; расположение остатков (справа) предсказали путем модельного построения. Зеленым показаны два аминокислотных остатка, непосредственно участвующих в катализе.

расщепляется ферментом, состоит в том, что NAM не может встать в положение остатка С. Если отлично умещается в участке С, то NAM здесь не умещается из-за лактильной боковой цепи. Между тем в полисахариде клеточной стенки бактерий лизоцим расщепляет связь Следовательно, и связь не может подвергаться расщеплению, если действительно полисахарид клеточных стенок бактерий связывается с лизоцимом таким же образом, как и гекса-NAG. Несоответствие NAM положению С исключает еще одно место гидролиза, а именно связь Вспомним, что полисахарид клеточной стенки - это чередующийся полимер NAM и следовательно, если NAM не может занимать положение С, то этот остаток не может стоять и в положении

Из приведенных соображений вытекает, что при расщеплении ферментом гексамерного субстрата связи и не могут разрываться. Следовательно, единственным возможным местом расщепления субстрата является связь (рис. 7.11).

3. Какая группа на ферменте непосредственно осуществляет катализ? Заключение о том, что гидролиз субстрата происходит по связи позволило перейти

Таблица 7.1. (см. скан) Эффективность олнгомеров N-ацетнлглю-козамина в качестве субстратов

Рис. 7.11

Ход рассуждений, доказывающих, что место приложения действия фермента - гликозидная связь между углеводными остатками

далее к выявлению тех групп на ферменте, которые непосредственно осуществляют реакцию гидролиза. Для этого, однако, нужно еще более точно локализовать место расщепления субстрата, а именно выяснить, по какую сторону от гликозидного атома кислорода происходит разрыв связи. Ответ на этот вопрос был получен в опытах по ферментативному гидролизу в среде, содержащей воду, меченную стабильным тяжелым атомом кислорода 180 (рис. 7.12). В выделенных по окончании гидролиза сахарах 180 оказался присоединенным к остатка тогда как гидроксильная группа при в остатке содержала обычный изотоп кислорода. Отсюда следует, что при гидролизе разрыв связи происходит между остатка D и кислородом гликозидной связи, примыкающим к остатку Эта работа может служить примером использования изотопов в изучении механизма ферментативного катализа. Без изотопов было бы крайне трудно, а может быть, и невозможно в данном случае установить точное место приложения действия фермента.

Затем перешли к поиску возможных каталитических групп, которые должны располагаться вблизи расщепляемой гликозидной связи. Как указывалось в предыдущей главе, под каталитическими группами подразумевают те группы фермента, которые непосредственно участвуют в образовании или разрыве ковалентных связей. Наиболее подходящие кандидаты на эту роль - это группы, способные к образованию водородных связей в качестве доноров или акцепторов водорода. Отрыв или присоединение иона водорода - это критический этап большинства ферментативных реакций. В лизоциме единственные остатки, способные быть каталитическими и расположенные вблизи расщепляемой гликозидной связи, - это аспартат-52 и глутамат-55. Остаток аспарагиновой кислоты лежит по одну сторону от гликозидной связи, а остаток глутаминовой - по другую. Окружение этих двух кислотных боковых цепей совершенно различно. Аспартат-52 находится в полярном окружении, где он служит акцептором водорода в сложной сети водородных связей. Глутамат-35, напротив, расположен в неполярной области. Отсюда следует, что при

Рис. 7.12. Проведение гидролиза в меченной 180 воде показало, что лизоцим расщепляет связь между но не связь между и О (изображен только скелет остатков

Рис. 7.13.

Структура части активного цен лизоцима. Желтым показаны кольца субстрата Вблизи субстрата расположены боковые цепи аспартата-52 (красное) и глутамата-35 (зеленое). [Lipscomb W.N., Ргос. Robert A, Wclch Found. Conf. Chem. Res, 15, 150 (1971.)]

оптимальном рН для гидролиза лизо-цимом хитина, аспарагиновая кислота в положении 52 должна находиться в ионизированной СОО-форме, тогда как глутаминовая кислота в положении 35-в неионизированной СООН-форме. Расстояние между гликозидной связью и ближайшим к ней атомом кислорода как одной, так и другой кислотной группы составляет примерно 3 А (рис. 7.13).