§ 16. Работы по методу распределительной хроматографии

Анализ смеси катионов кадмия, меди и ртути (II)

На бумагу, содержащую в порах неподвижный растворитель — воду, наносят анализируемый раствор смеси катионов и промывают хроматограмму подвижным растворителем. Если растворимые вещества имеют в данной паре растворителей разные коэффициенты распределения, то происходит разделение анализируемых катионов и выделение их в разных частях бумажного листа. Путем проявления полученной хроматограммы специфическими реагентами определяют вещества, входящие в анализируемую смесь.

Методика определения. Подготовка бумаги. Для анализа неорганических веществ может быть использована «бумага для хроматографии» (№ 1, 2) и фильтровальная бумага. Предварительно бумагу обрабатывают, погружая ее на 30 мин в 0,1 н. спиртовой раствор , затем отмывают от избытка щелочи дистиллированной водой и помещают на в -ный раствор , после чего полоски бумаги промывают дистиллированной водой и высушивают на воздухе.

Разделение катионов кадмия, меди и ртути (II). В середину полоски фильтровальной бумаги, соответствующей размеру камеры для получения хроматограммы, на расстоянии верхнего края микропипеткой наносят каплю раствора хлоридов меди, кадмия и ртути (II) в концентрации каждого иона. Тот же край бумаги погружают на глубину см в растворитель — н-бу-танол, насыщенный 1 н. раствором .

Когда растворитель пройдет на бумаге расстояние, равное 20—25 см, полоску вынимают, подсушивают при комнатной температуре и проявляют свежеприготовленным -ным раствором .

В нисходящей хроматограмме обнаруживают ионы по специфической окраске: внизу располагается черное пятно сульфида ртути (II), затем темно-коричневое — сульфида меди и дальше желтое — сульфида кадмия.

Расчет. Вычисляют (рис. 117) анализируемых ионов по следующей формуле:

где — путь, пройденный компонентом от центра нанесения капли раствора до центра пятна на хроматограмме, см; — путь, пройденный подвижным растворителем от места нанесения капли раствора до фронта движения растворителя, см.

Разделение, качественное и количественное определение аминокислот

Разделение сложной смеси аминокислот на составные части основано на различии коэффициентов распределения аминокислот в двух несмешивающихся растворителях. Для качественного анализа хроматограмму проявляют и определяют содержащиеся в растворе аминокислоты путем подбора «свидетелей» или расчета коэффициента .

Для количественного анализа проводят определения концентрации аминокислот по интенсивности окраски или размерам пятен хроматограмм, а также путем элюирования аминокислот из отдельных пятен и последующего определения их классическими количественными методами анализа.

Если пятна на хроматограмме перекрываются или по какой-либо причине контуры их искажаются, то данный метод не может быть использован для количественного определения.

Качественное определение аминокислот

Подготовка бумаги. Для разделения аминокислот используют «бумагу для хроматографии» № 1 и № 2. Бумагу тщательно отмывают 0,3 н. раствором , затем 0,5 н. раствором щелочи, избыток отмывают дистиллированной водой до отрицательной реакции по фенолфталеину, обрабатывают -ным фосфатным буферным раствором — 7,5) и высушивают.

Рис. 117. Экспериментальное определение компонентов на бумажной хроматограмме: — путь, пройденный соответственно первым и вторым (2) компонентами и растворителем; — точка нанесения пробы. — коэффициенты распределения соответственно первого и второго компонентов.

Предварительная обработка может быть исключена, если бумага не содержит ионов тяжелых металлов.

Растворитель. -Бутиловый спирт — уксусная кислота — вода (). Смесь встряхивают 1—2 мин и после расслаивания отделяют слои.

Проявитель — -ный раствор нингидрина в безводном ацетоне (200 мг нингидрина растворяют в чистого ацетона). Хранят проявитель в сосуде из темного стекла.

Растворы аминокислот «свидетелей». В качестве «свидетелей» применяют 0,01 М растворы чистых аминокислот. Навески аминокислот, необходимые для приготовления раствора (табл. 10), берут на аналитических весах и растворяют в воде или -ном изопропиловом спирте. Раствор тирозина подкисляют 0,1 н. раствором до его полного растворения.

ТАБЛИЦА 10. Навески аминокислот для приготовления растворов

Растворы для исследования. Для разделения берут следующие смеси аминокислот: 1) гистидин, глицин, валин, изолейцин (или лейцин); 2) аргинин, глутаминовая кислота, аланин, метионин; 3) лизин, серин, тирозин, фенилаланин; 4) цистин, аспарагиновая кислота, тирозин, пролин, триптофан.

Методика определения. На листе бумаги, соответствующем размеру камеры, на расстоянии 12 см от края, в случае применения больших камер, или 5 см, в случае применения малых, отмечают карандашом черту для нанесения капель раствора. Исследуемую смесь и растворы «свидетелей» в количестве наносят вдоль черты на расстоянии 2—3 см друг от друга. Капли наносят в два приема микропипеткой по в одно и то же место после высушивания предыдущей капли. Конец подсушенной бумаги, на который нанесены капли растворов, опускают в кювету с подвижным растворителем так, чтобы пятна исследуемых растворов не были погружены в растворитель. Хроматографируют нисходящим методом. В качестве подвижного растворителя применяют верхний слой смеси бутанола, уксусной кислоты и воды.

Нижний слой используют для насыщения атмосферы камеры, помещая его на дно. Когда фронт растворителя пройдет 2/3 длины бумаги, хроматограмму вынимают, высушивают и вновь пропускают через нее подвижный растворитель. Так хроматограмму обрабатывают трижды. При разделении смесей, содержащих небольшое число аминокислот, можно ограничиться однократным пропусканием подвижного растворителя.

После окончания разделения хроматограмму высушивают на воздухе и проявляют раствором нингидрина путем опрыскивания из пульверизатора. Затем нагревают 15—20 мин при 60° С в термостате или сушильном шкафу. Расположение аминокислот сверху вниз по направлению движения растворителя следующее: цистин, лизин, аргинин, гистидин, аспарагиновая кислота, серин (три последние аминокислоты располагаются в виде тесно сближенных пятен); глутаминовая кислота, треонин, аланин, пролин, тирозин, валин, метионин, триптофан, фенилаланин, лейцин, изолейцин (последние три аминокислоты также часто располагаются в виде тесно сближенных пятен).

Хроматограмму проявляют -ным раствором нингидрина в ацетоне. Для того чтобы сохранить пятна на хроматограмме, их фиксируют -ным раствором нитрата меди в ацетоне, погружая хроматограмму в этот раствор или опрыскивая ее из пульверизатора. После фиксации пятна приобретают красно-оранжевую окраску.

Качественный состав аминокислот в исследуемом растворе определяют путем сопоставления положения пятен известных веществ — «свидетелей» с положением пятен, полученных для анализируемого раствора.

Коэффициент определяют для каждой аминокислоты (см. рис. 117). Одна и та же аминокислота при одних и тех же условиях опыта имеет постоянную величину . По полученным величинам можно в последующих опытах определить качественный состав смеси аминокислот без применения «свидетелей».

Количественное определение аминокислот

Подготовка бумаги — см. стр. 299.

Растворитель — см. стр. 300.

Проявитель — -ный раствор нингидрина, который готовят растворением нингидрина в ацетоне, ледяной уксусной кислоте и воде непосредственно перед определением.

Калибровочный график. Для построения калибровочных графиков готовят 0,01 М растворы аминокислот. Навески аминокислот, необходимые для приготовления растворов, приведены выше (см. табл. 10).

С помощью микропинетки наносят на бумагу 5, 10, 15 и стандартного раствора порциями по с таким расчетом, чтобы каждая точка будущего калибровочного графика соответствовала 0,05; 0,10; 0,15 и аминокислоты.

Растворитель пропускают через бумагу столько раз, сколько это необходимо для четкого разделения аминокислот исследуемой пробы. Хроматограмму затем высушивают, проявляют, погружая на несколько секунд в -ный раствор нингидрина, снова подсушивают в течение нескольких минут на воздухе и нагревают для развития окраски (15 мин) в сушильном шкафу при 60° С.

Контуры пятен стандартных растворов на хроматограмме осторожно очерчивают карандашом и определяют их площади планиметром. Затем строят калибровочный график в координатах: натуральные логарифмы площадей пятен — концентрация аминокислот.

Концентрацию аминокислот в анализируемом растворе можно также вычислить по формуле:

где S — площадь; С — концентрация; а и — эмпирические коэффициенты.

Вместо площади можно определять массу пятна, для этого пятно вырезают и взвешивают. На основании полученных данных строят калибровочный график, откладывая на оси абсцисс натуральные логарифмы концентраций, а на оси ординат — массу пятен.

Для достаточной точности проводят 6—10 параллельных определений как для стандартных растворов, так и для каждой аминокислоты неизвестной концентрации. В этом случае точность метода определяется правильно найденными границами пятен и выбранными концентрациями, при которых наблюдается линейная зависимость между площадью (массой) пятна и .

Методика определения. Предварительно проводят калибрование микропипетки, для этого ее заполняют дистиллированной водой, затем на маленький кружок фильтровальной бумаги, взвешенный в бюксе, выливают содержимое микропипетки, касаясь ее концом бумаги. Бюкс закрывают и взвешивают на аналитических весах. Определение повторяют 5—6 раз. Результаты определений вносят в таблицу и рассчитывают объем микропипетки (в ) по формуле:

где — масса воды, г; — плотность, г/см3.

Результаты исследования заносят в таблицу по форме:

За истинный объем пипетки (V) принимают среднее арифметическое всех определений. Объем микропипетки должен быть не больше . Можно также использовать калиброванные медицинские пипетки.

Раствор аминокислот микропипеткой наносят на полоску бумаги и проводят хроматографирование, как указано выше (см. стр. 300). Определив площади пятен или их массу, по калибровочным графикам находят концентрации аминокислот в анализируемом растворе.

Определение путем элюирования аминокислот из бумаги с последующим фотоколориметрированием

Метод основан на реакции аминокислот с нингидрином в слабокислой среде с последующим превращением полученного в результате реакции синего производного дикетогидринделидендикетогидриндиамина (ДИДА) в стабильное производное меди оранжево-красного цвета, имеющее максимум поглощения при 530 нм.

Количественное определение аминокислот основано на измерении оптической плотности производного меди (ДИДА) после вымывания его из бумаги.

Линейная зависимость между содержанием аминокислоты в пятне и оптической плотностью сохраняется в пределах аминокислоты; оптимальное содержание аминокислоты в зоне . Оптимальной средой для работы является слабокислая среда в пределах

Методика определения. Хроматографическое разделение аминокислот проводят по методике, описанной выше (см. стр. 300). После развития хроматограммы вырезают участки пятен, занимаемые аминокислотами; сбоку хроматограммы вырезают равные по площади опытным контрольные участки, не содержащие определяемых веществ.

Вырезанные участки бумаги измельчают ножницами и помещают в колбы. В каждую колбу добавляют по -ного этанолового раствора сульфата меди. Объем доводят до -ным этиловым спиртом. Синяя окраска аминокислот сменяется оранжево-красной при образовании производного меди, которое растворимо в этиловом спирте. При данной операции совмещается образование комплексного соединения с медью и его экстракция из бумаги.

Колбы помещают в темное место и оставляют на , время от времени перемешивая их содержимое. Окрашенные растворы фотометрируют в фотоэлектроколориметре ФЭК-М с зеленым светофильтром (530 нм). Затем строят калибровочный график, откладывая на оси абсцисс концентрацию аминокислоты — , а на оси ординат — оптическую плотность. По калибровочному графику находят концентрацию исследуемой кислоты.

Определение проводят в тех же условиях, в которых готовят растворы для построения калибровочного графика.

Анализ смесей красителей

Разделение красителей методом распределительной хроматографии основано на использовании различной величины их коэффициентов распределения между двумя несмешивающимися жидкостями. При проявлении хроматограммы образуются ярко окрашенные пятна составных компонентов, и состав красителя определяют по сопоставлению этих пятен со «свидетелями».

Методика определения. Для анализа красителей в качестве распределительной камеры применяют небольшой эксикатор. На дно камеры помещают стакан емкостью , в который наливают подвижный растворитель — н. раствора едкого натра. Вырезают круг из бумаги для хроматографии № 1 или № 2 диаметром на 1 см меньше внутреннего диаметра камеры. В центре бумажного круга делают отверстие, в которое вставляют бумажный конус (диаметр внизу см) для подачи подвижного растворителя.

Бумажный круг делят карандашом на четыре сектора. На расстоянии 2 см от центра по окружности в первый сектор наносят каплю (объемом ) -ного водного раствора красителя кислотного черного, а в последующие секторы — -ные водные растворы «свидетелей» кислотного сине-черного, кислотного оранжевого светопрочного, кислотного бордо.

Круг переносят в камеру так, чтобы бумажный конус был погружен в подвижный растворитель. Камеру накрывают крышкой и оставляют для развития хроматограммы на . Затем хроматограмму вынимают из камеры, высушивают на воздухе и по распределению и цвету пятен «свидетелей» и распределению компонентов определяют состав исследуемого образца красителя.

Аналогично проводят анализ красителя кислотного черного .

Разделение катионов меди и кадмия методом тонкослойной хроматографии

Разделение методом тонкослойной хроматографии основано на использовании различия коэффициентов распределения этих ионов между водой и подвижным растворителем. Хроматограмму проявляют путем опрыскивания проявителем — раствором . В местах расположения ионов при этом возникают пятна сульфидов, обладающие характерной окраской.

Методика определения. На стеклянную пластинку размером 20 X 20 или 20 X 25 см помещают предварительно просеянную безводную окись алюминия (размер частиц не должен превышать . Окись алюминия или носитель распределяют на пластинке металлическим валиком до толщины слоя не более . В качестве подвижного растворителя применяют смесь, состоящую из -бутанола, ацетона и азотной кислоты ). В качестве «свидетелей» используют 0,5 н. растворы . В правый угол приготовленной пластинки, на расстоянии 2 см от края ее, наносят капилляром каплю исследуемого раствора смеси , содержащего каждый ион в концентрации . Через 1,5 см по ширине пластинки наносят еще каплю исследуемого раствора для параллельного опыта и дальше через каждые 1,5 см — по капле раствора «свидетелей» (солей кадмия и меди). Таким образом, наносят четыре пятна. Диаметр наносимого пятна не должен быть более 2 мм, иначе разделение ионов будет неполное. Пластинку помещают в камеру, на дно которой наливают растворитель. Пластинку ставят в наклонном положении так, чтобы слой носителя не осыпался с нее, нижний край пластинки осторожно погружают в растворитель на 1 см.

Пятна с исследуемым раствором и «свидетелями» должны находиться выше уровня растворителя на 1 см. Камеру закрывают и оставляют на 50 мин для развития хроматограммы. Время развития хроматограммы зависит от влажности носителя. После того как подвижный растворитель поднимется по тонкому слою носителя на высоту не менее 17 см, пластинку вынимают, подсушивают при комнатной температуре и проявляют путем опрыскивания ее 1 н. раствором .

На хроматограмме проявляются два пятна: выше — желтое , ниже — черное . Сравнивая окраски полученных пятен от исследуемого раствора с пятнами «свидетелей», можно определить содержание в растворе.

По полученной хроматограмме можно определить также величину для каждого катиона (см. § 16, стр. 299).

Определение жирных кислот методом «обращенных фаз»

В методе «обращенных фаз» неподвижным растворителем является неполярное органическое вещество, а подвижным — полярное органическое соединение. В качестве носителя применяют бумагу, предварительно гидрофобизированную путем ацетилирования. Разделение жирных кислот проводят «восходящим способом» с использованием метода «свидетелей».

После разделения веществ хроматограмму проявляют и, сопоставляя расположение пятен в хроматограмме с расположением пятен «свидетелей», определяют состав исследуемого вещества.

Методика определения. Приготовление ацети лированной гидрофобной бумаги. Лист фильтровальной бумаги № 2 размером 10 X 35 см для удаления катионов тяжелых металлов промывают -ным раствором уксусной кислоты до обесцвечивания элюата и высушивают. Ацетилирующую смесь готовят из уксусного ангидрида и петролейного эфира по объему), добавляя 1—2 капли концентрированного раствора на каждые , и тщательно перемешивают. Полоску бумаги опускают в ацетилирующую смесь на 40 мин, после чего бумагу промывают 3—4 раза, выдерживая ее по 15 мин в дистиллированной воде, затем высушивают при комнатной температуре. При дальнейшем использовании смеси время каждого последующего ацетилирования следует увеличивать на 5—10 мин.

Получение хроматограмм. На подготовленные листы бумаги наносят растворы смеси двух-трех кислот в количестве каждого компонента — общее содержание кислот должно быть около — и растворы «свидетелей» (интервал 1,5 см). В качестве подвижного растворителя применяют ледяную уксусную кислоту. Подвижный растворитель наливают в стеклянную кювету и в нее помещают нижний конец полосы бумаги. Время экспозиции . После чего бумагу вынимают, высушивают до полного удаления уксусной кислоты (определяют по исчезновению запаха уксусной кислоты). Высушенную бумагу выдерживают в течение в сильной струе воздуха (воздуходувка), нагретого до 30—80° С. Затем бумагу вынимают, свертывают в виде цилиндра и проявляют.

Для этого хроматограмму помещают на 30 мин в раствор ацетата меди насыщенного водного раствора , смешивают с дистиллированной воды]. Избыток ацетата меди отмывают в проточной воде в течение 30 мин и помещают хроматограмму на 5—10 мин в разбавленный раствор гексацианоферрата (II) калия (-ного водного раствора смешивают с дистиллированной воды). При этом пятна медных солей кислот окрашиваются в интенсивный темно-красный цвет. Фон остается светло-желтым или светло-красным.

Идентификацию отдельных пятен проводят при помощи «свидетелей», а также но величинам (см. стр. 299).

В качестве растворов «свидетелей» используют -ные растворы жирных кислот в диэтиловом эфире.