22.15. Дезоксирибонуклеотнды синтезируются путем восстановления рибонуклеозиддифосфатов

Перейдем теперь к синтезу дсзоксирибо-нуклеотидов, Эти предшественники ДНК образуются путем восстановления рибонуклеотидов. 2-гидроксильная группа остатка рибозы замещается атомом водорода.

В клетках E.coli и млекопитающих субстратами этой реакции служат рибонуклео-зиддифосфаты. Общая стехиометрия этой реакции следующая:

В действительности механизм реакции гораздо сложнее, чем можно судить по этому уравнению. Питер Рейхард (Peter Reichard)

показал, что у E. coli электроны переносятся на субстрат через ряд сульфгидрильных групп. Заключительную реакцию катализирует рибонуклеотид-редуктаза (ее также называют рибонуклеозиддифосфат-редуктазой). Стехиометрия этой реакции описывается следующим уравнением:

Этот фермент состоит из двух субъединиц: (димер с мол. массой (димер с мол. массой 78 кДа), В субъединице имеются участки связывания рибонуклеотидных субстратов и аллостерических эффекторов. Кроме того, содержит сульфгидрильные группы, которые служат непосредственными донорами электронов при восстановлении рибозного остатка. -белок, содержащий железо и серу; он участвует в катализе, образуя необычный свободный радикал ароматического кольца тирозинового остатка, Субъединицы вместе участвуют в формировании активных центров фермента (рис. 22.18).

Каким образом электроны переносятся с NADPH на сульфгидрильные группы в каталитическом центре рибонуклеотид-редуктазы?

Рис. 22.18. Модель рибонуклеотид-редуктазы Е, coli. [Thelander L., Reichard P., Ann. Rev. Biochem., 48, 136 (1979).]

Один из переносчиков восстановительного потенциала - тиоредоксин, белок с мол. массой 12000 Да, содержащий два цистеиновых остатка в непосредственной близости друг от друга (рис. 22.19). Эти сульфгидрильные группы окисляются, образуя дисульфид в результате реакции, катализируемой рибонуклеотид-редуктазой. Восстановленный тиоредоксин в свою очередь регенерируется в ходе реакции NADPH с окисленным тиоредоксином.

Рис. 22.19. Схематическое изображение конформации основной цепи окисленного тиоредоксина Е. coli. Желтым цветом показана реакционноспособная дисульфидная связь, участвующая в реакции. (Печатается с любезного разрешения д-ра Carl-fvar Branden,)

Рис. 22.20. Рибонуклеозиддифосфаты восстанавливаются до дезокеирибонуклеозиддифосфатов под действием рибонуклеотид-редуктазы. Электроны переносятся с молекулы NADPH через ряд сульфгидрильных групп, Источниками восстановительной способности могут служить тиоредоксиновая система (обозначено желтым цветом) и глутаредоксиновая система (обозначено зеленым цветом),

Эта реакция катализируется флавопротеином тиоредоксин-редуктазой: Раньше считалось, что тиоредоксин - единственный переносчик восстановительной способности на рибонуклеотид-редуктазу. Однако было обнаружено, что мутант E. coli, полностью лишенный тиоредоксина, синтезирует дезоксирибонуклеотиды. Это неожиданное открытие привело к выделению второй системы переносчиков. Оказалось, что донор электронов у этого мутанта - цистеинсодержащий трипептид глутатион. Как говорилось выше (разд. 15.12), глутатион-редуктаза катализирует восстановление окисленного глутатиона (дисуль-фидной формы) за счет NADPH. Кроме того, для переноса восстановительной способности глутатиона на рибонуклеотид-редуктазу нужен еще один белок глутаредоксин (рис. 22.20). Соотношение активностей тиоредоксиновой и глутаредоксиновой систем в восстановлении рибонуклеотидов в нормальных клетках пока неизвестно.

Восста новление рибо ну еотиддифосф -тов тонко регулируется аллостерическими взаимодействиями. Субъединица рибонуклеотид-редуктазы содержит два типа аллостерических участков: один из них регулирует общую активность фермента, другой - субстратную специфич ность. Общая каталитическая активность рибонуклеотид-редуктазы снижается при связывании dATP, который сигнализирует об изобилии дезоксирибонуклеотидов, Это ингибирование по механизму обратной связи обращается при связывании АТР. Связывание dATP или АТР с участками, регулирующими субстратную специфичность, увеличивает восстановление пири-мидиннуклеотидов UDP и CDP. Восстановление GDP стимулируется связыванием dTTP, который также ингибирует восстановление пиримидиннуклеотидов. Последующее увеличение концентрации dGTP приводит к стимуляции восстановления ADP. Очевидно, рибонуклеотид-редуктаза имеет множество конформационных состояний с различными каталитическими свойствами. Эта сложная схема регуляции обеспечивает синтез достаточного количества четырех дезоксирибонуклеотидов для синтеза ДНК.