14.6. Протонный градиент генерируется в трех пунктах

Выброс протонов происходит в трех пунктах потока электронов по дыхательной цепи от NADH к (рис. 14.9): 1-й пункт - это NADH-Q-редуктазный комплекс; 2-й пункт - -цитохром-с - редуктазный комплекс; 3-й пункт - цитохром-с-оксидазный комплекс. Протонный градиент, генерируемый в каждом из пунктов при переносе пары электронов от NADH, используется для синтеза одной молекулы АТР. Для идентификации этих пунктов применялись различные экспериментальные подходы.

1. Сравнение выхода АТР при окислении нескольких субстратов. Окисление NADH дает три АТР, тогда как окисление сукцината дает два АТР. Электроны от поступают в цепь переноса электронов на

уровне кофермента который находится на более низком энергетическом уровне, чем

1-й пункт фосфорилирования. При окислении нефизиологического субстрата аскорбата образуется только одна молекула АТР, потому что электроны аскорбата поступают на цитохром с, находящийся на более низком энергетическом уровне, чем 2-й пункт фосфорилирования. Окислительное фосфорилирование часто характеризуют отношением -число молей неорганического фосфата, включающегося в органическую форму, в расчете на один атом потребляемого кислорода. Отношения О для окисления NADH, сукцината и аскорбата составляют соответственно 3, 2 и 1.

2. Термодинамические измерения. Значение для переноса электронов от NADH на находящийся на более низком энергетическом уровне Fe-S-центр в NADH-Q-peдуктазе составляет — 12 ккал/моль; для переноса электронов от цитохрома к в -цитохром-с - редук газе - 10 ккал/моль и от цитохрома в цитохром-r-оксидазе - 24 ккал/моль. Эти окислительно-восстановительные реакции являются в достаточной степени экзергоническими для запуска синтеза АТР при стандартных условиях ккал/моль). Значения для других реакций переноса электронов, опосредуемых кофермснтом и цитохромом с, слишком малы для поддержания синтеза АТР.

3. Специфическое ингибирование тока электронов. Ротенон и амитал специфически ингибируют перенос электронов в NADH-Q-редуктазном комплексе и таким образом предотвращают генерирование протонного градиента в пункте (см, рис, 14.9). В то же время указанные ингибиторы не нарушают окисления сукцината, поскольку электроны этого субстрата поступают в цепь переноса электронов после блока кофермента Лнтимицин А тормозит ток электронов между цитохромами предотвращая синтез АТР, сопряженный с генерированием протонного градиента во 2-м пункте. Этот блок можно обойти добавлением аскорбата, который непосредственно восстанавливает цитохром с. Электроны затем пойдут цитохрома с к с одновременным синтезом АТР, сопряженным с протонным градиентом в пункте. Наконец, ток электронов может быть блокирован между цитохромоксидазным комплексом и под действием и Цианид и азид реагируют с ферриформой этого переносчика, тогда как оксид углерода ингибирует ферроформу. В присутствии этих ингибиторов из-за блокирования тока электронов не происходит фосфорилирования, сопряженного с генерированием протонного градиента в пункте.

Места действия этих ингибиторов были установлены с использованием метода перекреста. Бриттон Чане (Britton Chance) предложил изящный спектроскопический метод для определения соотношения окисленной и восстановленной форм каждого переносчика. В основе метода лежит тот факт, что окисленная и восстановленная формы каждого переносчика имеют свои характерные спектры поглощения. Добавление ингибитора переноса электронов изменяет соотношение этих форм. Например, добавление антимицина А вызывает переход переносчиков, локализованных в электронтранспортной цепи между NADH и цитохромом в более восстановленное состояние, а переносчиков между цитохромом более окисленное состояние. Отсюда можно заключить, что антимицин А подавляет превращение цитохрома в цитохром потому что этот этап является пунктом перекреста.

4. Синтез системы пузырьков, содержащих лишь один пункт выброса протонов. Каждый из трех участков выброса прогонов был воспроизведен в синтетических фосфо-липидных пузырьках, содержащих АТРазу. Добавление к таким пузырькам окисляемого субстрата приводит к генерированию протонодвижущей силы, достаточной для синтеза одной молекулы АТР на пару электронов.