13.10. Пируват-дегидрогеиазиый комплекс - организованная система ферментов

Обратимся теперь к механизму некоторых реакций. Окислительное декарбоксилирование пирувата с образованием ацетил-СоА катализируется пируват-дегидрогеназным комплексом, организованной системой трех видов ферментов (табл. 13.2). Превращения, катализируемые этим комплексом, описываются следующим

Таблица 13.1. (см. скан) Цикл трикарбоновых кислот

Таблица 13.2. (см. скан) Пнруват-дегнлрогеназнын комплекс

суммарным уравнением:

Механизм этой реакции гораздо сложнее, чем можно было бы думать, исходя только из ее стехиометрии. Помимо стехиометрических кофакторов СоА и NAD+ в ней в качестве каталитических кофакторов участвуют тиаминпирофосфат (ТПФ), липоамид и FAD.

Превращение пирувата в ацетил-СоА происходит в четыре стадии. На первой стадии пируват соединяется с ТПФ и затем подвергается декарбоксилированию. Реакция катализируется пируват-дегидрогеназным компонентом мультиферментного комплекса.

Решающее значение для данного процесса имеет следующая особенность ТПФ, простетической группы пируват-дегидрогеназного компонента: очень кислый характер атома углерода, находящегося между атомами азота и серы тиазолового кольца. Он ионизируется, образуя карбанион, который легко присоединяется к карбонильной группе пирувата.

Положительно заряженный азот в кольце ТПФ принимает на себя электроны, стабилизируя формирование отрицательного заряда, необходимого для декарбоксилирования. Затем протонирование приводит к образованию гидроксиэтиламинпирофосфата.

На второй стадии гидроксиэтильная группа, связанная с ТПФ, окисляется с образованием ацетильной группы и одновременно переносится на липоамид. Окислителем в этой реакции служит дисульфидная группа липоамида, которая превращается в сульфгидрильную группу.

Рис. 13.6. Модель тиаминпирофосфата.

Реакция катализируется дигидролипоилтрансацетилазным компонентом комплекса и приводит к образованию ацетиллипоамида.

На третьей стадии ацетильная группа переносится с ацетиллипоамида на СоА,

(см. скан)

Рис. 13.7. Структура липоевой кислоты и липоамида. Липоевая кислота ковалентно присоединена к специфической лизиновой боковой цепи дигидролипоил-трансацетилазы. Отметим, что эта простетическая группа находится на конце длинной гибкой цепи, которая позволяет ей поворачиваться от одного активного центра к другому в составе ферментного комплекса.

образуя ацетил-СоА. Процесс также катализируется дигидролипоил=трансацетилазой. При переходе ацетильной группы на СоА сохраняется богатая энергией тиоэфирная связь.

На четвертой, завершающей стадии происходит регенерирование окисленной формы липоамида. Реакция катализируется диги-дролипоил -дегидрогеназным компонентом комплекса. Окислителем в ней служит NAD+, а роль простетической группы фермента выполняет FAD.

Источником сведений, проливших свет на структуру и сборку пируват-дегидрогеназного комплекса, явились исследования Лестера Рида (Lester Reed). Интенсивному изучению был подвергнут ферментный комплекс из Е. coli. Было установлено, что

(см. скан)

его мол. масса и что он состоит из 48 полипептидных цепей. На электронной микрофотографии отчетливо видна структура многогранника с диаметром около 300 А (рис. 13.9). Ядро (сердцевину) пируват-дегидрогеназного комплекса составляют полипептидные цепи трансацетилазы. Пируват-дегидрогеназный и липоил-дегидрогеназный компоненты связываются с наружной стороной этого ядра, состоящей из трансацетилазных компонентов (рис. 13.10).

Составляющие комплекс полипептидные цепи удерживаются вместе нековалентными силами. При щелочных значениях рН комплекс диссоциирует на пируват-дегидрогеназный компонент и субкомплекс из двух других ферментов. Трансацетилазу можно затем отделить от дегидрогеназы при нейтральных значениях рН в присутствии мочевины. После смешивания при нейтральном значении рН в отсутствие мочевины происходит самопроизвольная ассоциация этих трех ферментов с образованием пируват-дегидрогеназного комплекса. Таким образом, нативный ферментный комплекс может, по-видимому, образовываться путем самосборки.

Рис. 13.8. Модель липоильной части липоамида.

Структурное объединение трех видов ферментов делает возможным координированный катализ при осуществлении сложной реакции (рис. 13.11). Все промежуточные продукты реакции окислительного декарбоксилирования пирувата прочно связываются с комплексом. Тесная близость между ферментами увеличивает суммарную скорость процесса и сводит к минимуму побочные реакции. Активированные промежуточные продукты переносятся от одного активного центра к другому

Рис. 13.9. Электронная микрофотография пируват-дегидрогеназного комплекса из Е. colL (Печатается с любезного разрешения д-ра Lester Reed.)

Рис. 13.10. Модель пируват-дегидрогеназного комплекса из Е. coll (Печатается с любезного разрешения д-ра Lester Reed.)

Рис. 13.11. Перечень реакций, катализируемых пируват-дегидрогеназным комплексом. L обозначает лияоильную группу.

липоамидной простетической группой трансацетилазы Присоединение липоильной группы к е-аминогруппе лизинового остатка трансацетилазы создает гибкий рычаг для реакционноспособного о кольца. Этот молекулярный рычаг в 14 А способствует взаимодействию липоильной части транс-ацетилазной субъединицы с тиаминпиро-фосфатным компонентом соседней пируват-дегидрогеназной субъединицы и с флавиновым компонентом соседней липоил-дегидрогеназы. Кроме того, липоильные компоненты мультиферментного комплекса могут реагировать друг с другом, образуя сеть взаимодействующих реакционно-способных групп. Заряд липоильного компонента в течение цикла его превращений составляет 0, -1 или — 2 при полной ионизации сульфгидрильных групп. Эти изменения заряда могут служить движущей силой для направленного движения липоильной группы.