37.9. Определение структуры пептидов. Определение концевых групп. Частичный гидролиз
Для того чтобы выяснить структуру данного пептида, необходимо знать следующее: а) какие аминокислоты входят в состав молекулы; б) сколько аминокислот каждого вида имеется в молекуле; в) в какой последовательности связаны они в цепи.
Для определения состава пептида его подвергают гидролизу (в кислом растворе, поскольку щелочь вызывает рацемизацию) и определяют количество каждой из образующихся при этом аминокислот. Одним из наилучших способов анализа смесей аминокислот является разделение смеси на компоненты хроматографией, а иногда, после превращения в метиловые эфиры (зачем?), газовой хроматографией.
Зная весовое содержание каждой из полученных аминокислот, можно вычислить число молей каждой аминокислоты и тем самым установить относительное число различных аминокислотных остатков в пептиде. Таким способом мы устанавливаем то, что называется «эмпирической формулой» пептида, т. е. относительное содержание остатков различных аминокислот в пептиде.
(см. скан)
Для вычисления «молекулярной формулы» пептида, т. е. установления действительного числа каждого из остатков в молекуле пептида, необходимо знать его молекулярный вес. Молекулярный вес можно определить как химическими, так и различными физическими методами: измерение осмотического давления или рассеяние света, изучение поведения при ультрацентрифугировании, дифракции рентгеновских лучей.
(см. скан)
Наконец, остается выполнить самую трудную часть задачи — выяснить, в какой последовательности связаны между собой аминокислотные остатки, т. е. структурную формулу пептида. Для решения этого вопроса используют комбинацию двух методов: определение концевых групп и частичный гидролиз.
Определение концевых групп заключается в идентификации аминокислотных остатков на концах пептидной цепи. Применяемая методика основана на том, что остатки на концах цепи отличаются по свойствам от всех остальных звеньев и друг от друга: один 
-концевой остаток) содержит свободную аминогруппу, а другой (С-концевой остаток) — свободную карбоксильную группу в 
-положении к пептидной связи.
Очень успешный метод идентификации N-концевого остатка (разработанный в 1945 г. 
Сэнджером в Кембриджском университете) основан на
использовании 
-динитрофгорбензола (ДНФБ), который вступает в реакцию нуклеофильного замещения со свободной аминогруппой с образованием N-динитрофенильного производного (ДНФ). Замещенный пептид подвергают гидролизу до аминокислот, после него N-концевой остаток, меченный 
-динитро-фенильной группой, выделяют и идентифицируют.
Другой метод определения N-концевых групп (разработанный в 1950 г. П. Эдманом в Университете Лунда, Швеция) основан на реакции между аминогруппой и фенилизотиоцианатом, приводящей к образованию замещенной мочевины (ср. разд. 29.14). Гидролиз соляной кислотой в мягких условиях селективно удаляет N-концевой остаток в виде фенилтиогидантоина, который затем идентифицируют. Большое преимущество этого метода состоит в том, что он не затрагивает остальной части пептида; поэтому анализ можно вновь повторить и идентифицировать при этом следующую концевую группу в укороченном пептиде. В идеале этот метод можно использовать многократно до полного определения всей последовательности звеньев, аминокислота за аминокислотой; однако на практике это оказывается неосуществимым.
Наиболее успешным методом определения С-концевых остатков является не химический метод, а ферментативный. Селективное удаление С-концевого звена осуществляется при помощи фермента карбоксипептидазы (из поджелудочной железы), которая расщепляет лишь ту пептидную связь, которая расположена в 
-положении к свободной 
-карбоксильной группе в полипептидной цепи. Анализ можно повторить на укороченном пептиде с тем, чтобы идентифицировать новый С-концевой остаток и т. д.
Однако на практике невозможно определить последовательность остатков в длинной пептидной цепи путем ступенчатого удаления концевых остатков.
Вместо этого цепь подвергают частичному гидролизу (кислотному или ферментативному) и образующиеся фрагменты — дипептиды, трипептиды и т. д. — идентифицируют при помощи метода определения концевых групп. Как только удастся идентифицировать достаточное число подобных небольших фрагментов, можно установить последовательность звеньев во всей цепи.
Разберем предельно простой пример: существует шесть возможных способов соединения трех аминокислот, образующих глутатион. Частичный гидролиз до дипептидов — глутамилцистеина 
и цистеинилглицина 
показывает, что цистеин находится в середине молекулы и правильной последовательностью звеньев будет 
Таким путем были установлены структуры окситоцина и 
-кортикотропина (стр. 1047). Одним из наиболее замечательных достижений в этой области было установление полной последовательности аминокислот в молекуле инсулина, выполненное в Кембриджском университете группой, руководимой Ф. Сэнджером, который за эту работу был удостоен Нобелевской премии в 1958 г. (см. задачу 12, стр. 1067). Число пептидов и белков, структуры которых полностью расшифрованы, постоянно увеличивается; сюда относится гемоглобин, содержащий четыре цепи, в каждой из которых имеется более 140 аминокислотных остатков, и химотрипсиноген, цепь которого содержит 246 остатков.
Как и всегда, структура, приписанная пептиду, окончательно подтверждается его синтезом при помощи метода, позволяющего однозначно получить соединение с данной структурой. Эта проблема будет обсуждена в следующем разделе.
(см. скан)
